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Charakterisierung der Expression und Funktion metabolischer Enzyme im humanen intestinalen Gewebe

  • Bei der Arzneimittelentwicklung liegt der Fokus nicht nur auf der Wirksamkeit und Sicherheit einer pharmakologisch aktiven Substanz, sondern auch auf einer möglichst einfachen, idealerweise oralen Applikation. Um die benötigten Wirkstoffkonzentrationen im Zielorgan zu erreichen, wird die einzunehmende Dosis eines Medikaments in Abhängigkeit der präsystemischen Elimination ermittelt. Inzwischen ist bekannt, dass nicht ausschließlich der hepatische, sondern auch der intestinale Stoffwechsel die orale Bioverfügbarkeit eines Medikaments wesentlich beeinflussen kann. Arzneistoffe, die während der Darmpassage einer starken Metabolisierung unterliegen, sind zudem prädestiniert für unerwünschte Interaktionen mit anderen Substanzen, welche die entsprechenden Stoffwechselenzyme hemmen oder induzieren. Für die Abschätzung pharmakokinetischer Parameter eines neuen Wirkstoffs sind daher Kenntnisse zur Expression sowie Funktion klinisch relevanter intestinaler Stoffwechselenzyme von Bedeutung. Bisher publizierte Daten basieren größtenteils auf der Genexpression, obwohl aufgrund posttranskriptionaler Prozesse nicht zwingend Aussagen zur resultierenden Proteinmenge getroffen werden können. Die verfügbaren Daten zum intestinalen Proteingehalt wurden mittels immunologischer Methoden erhoben, die erhebliche Limitationen in Bezug auf Spezifität, Reproduzierbarkeit und Robustheit aufweisen. Diese Aspekte finden bei den inzwischen etablierten LC-MS/MS-basierten Targeted-Proteomics-Methoden Berücksichtigung. Dazu werden die Proteine einer Messprobe enzymatisch gespalten, um entstehende proteospezifische Peptide zur Quantifizierung der Proteine von Interesse zu nutzen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung und Validierung einer entsprechenden Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 sowie UGT2B15 in biologischen Matrices, welche die aktuell gültigen Leitlinien in Bezug auf Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision und Stabilität erfüllt. Bereits bei der ersten Anwendung der Methode zur Quantifizierung der Enzyme in kommerziell erhältlichen und selbst isolierten Mikrosomen zeigte sich, welchen erheblichen Einfluss die Probenvorbereitung auf die ermittelten Proteingehalte hat. Diese Erkenntnis wurde im Rahmen eines internationalen Projektes bestätigt, bei dem humane Leberproben desselben Ursprungs in diversen Laboren mit den dort etablierten Methoden prozessiert worden sind. Bezogen auf die eingesetzte Gewebemenge ergaben sich bei der Messung der Mikrosomen 6 - 30-fach geringere Enzymgehalte als bei der Analyse des nicht-fraktionierten Gewebes, da die subzelluläre Aufspaltung einer Probe mit erheblichen Proteinverlusten einhergeht. Folglich wurden alle weiteren Untersuchungen zur absoluten Enzymquantifizierung unter Verwendung von filterbasierten Zentrifugaleinheiten (filter aided sample preparation; FASP) mit Gesamtgewebelysatproben durchgeführt. Sowohl die optimierte Probenaufarbeitung als auch die validierte Targeted-Proteomics-Methode fanden bei der Untersuchung der Darmsegmente von 9 Spendern Anwendung, wobei jeweils Gewebe aus dem Duodenum, oberen und unteren Jejunum, Ileum sowie Colon zur Verfügung stand. Von den 13 untersuchten Enzymen wurden in allen Dünndarmabschnitten nur CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3 und UGT2B7 nachgewiesen, deren Gehalt im Jejunum am höchsten war. Im Colon wurde auf Proteinebene keines der Metabolisierungsenzyme detektiert. Die entsprechenden Genexpressionsdaten dieser 8 Enzyme korrelieren signifikant mit den ermittelten Proteinwerten. Korrespondierend zur fehlenden Nachweisbarkeit der übrigen 5 Enzyme auf Proteinebene waren die Gene CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1 sowie UGT2B15 nur sehr geringfügig und CYP1A2 gar nicht exprimiert. Zur Charakterisierung der metabolischen Aktivität der intestinalen Enzyme wurde eine weitere LC-MS/MS-basierte Methode entwickelt und validiert. Als Modellsubstrate fungierten Diclofenac (CYP2C9), Omeprazol (CYP2C19), Dextromethorphan (CYP2D6), Midazolam (CYP3A), Ezetimib (UGT1A) und Naloxon (UGT2B7). Die begrenzte Verfügbarkeit des intestinalen Gewebes sowie dessen sehr geringer mikrosomaler Proteingehalt stellten besondere Anforderungen an die Sensitivität der Methode. Ihre Eignung zur Charakterisierung der intestinalen Metabolisierungsaktivität wurde bei der Anwendung auf ein jejunales Mikrosomen-Gemisch gezeigt. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten zur Expression klinisch bedeutsamer Metabolisierungsenzyme entlang des humanen Darms tragen zu einem besseren Verständnis des intestinalen First-Pass-Metabolismus bei. Diese Kenntnisse können sowohl bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe als auch für die Erstellung von Physiologie-basierten pharmakokinetischen Modellen (PBPK-Modellen) nützlich sein, um die orale Bioverfügbarkeit sowie das Interaktionspotential pharmakologisch aktiver Substanzen abzuschätzen.
  • When developing drug products the focus lies not solely on efficacy and safety of an active pharmaceutical ingredient, but also on an easy, ideally oral application. To reach the necessary concentration in the target organ the required dosage of a drug product is determined based on its pre-systemic elimination. Today it is well-known that the oral bioavailability is not only influenced by the hepatic, but also the intestinal metabolism. Drug products undergoing considerable metabolism during intestinal passage are prone for adverse interactions with other substances that could inhibit or induce the corresponding metabolizing enzymes. Hence, knowledge about expression and activity of clinically relevant intestinal enzymes are of importance to estimate pharmacokinetic parameters. Available data are mainly based on gene expression although protein abundance might not necessarily be concluded correctly due to posttranscriptional processes. So far the intestinal protein abundance has been determined using immunologic methods which are associated with limitations in regards to specificity, reproducibility and robustness. LC-MS/MS based targeted proteomics addressing those aspects have been established by now. These methods utilize proteospecific peptides resulting from enzymatic digest of a sample to quantify proteins of interest. A respective method to simultaneously determine CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 as well as UGT2B15 in biological matrices has been developed and validated according to current guidelines concerning selectivity, linearity, accuracy, precision and stability. Its first application on commercially available and in-house isolated microsomes already revealed the substantial influence of sample preparation on the determined protein abundance. This finding has been confirmed within the scope of an international project comparing human liver samples of the same origin in different laboratories according to in-house preparation methods. With reference to the processed tissue amount analyses of microsomes showed 6 to 30 times lower enzyme abundance compared to whole tissue approaches. Those differences are attributed to considerable protein losses during subcellular fractionation of a sample. Subsequently, further investigations to absolutely quantify enzyme abundance were performed with whole tissue lysate using filter aided sample preparation (FASP). Intestinal tissue of 9 donors was investigated applying the optimized sample preparation in combination with the validated targeted proteomics method. In each case duodenum, upper and lower jejunum, ileum as well as colon had been provided. Out of the 13 aforementioned enzymes only CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3 and UGT2B7 were found in the small intestine with highest abundance in jejunum. None of the enzymes were detected in colonic tissue. Respective gene expression of these 8 enzymes correlates significantly with the determined protein abundance. The low expression of CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1 as well as UGT2B15 and absence of CYP1A2 is in accordance with the lack of these enzymes on protein level. Another LC-MS/MS based method has been developed and validated to characterize the metabolic activity of the detected intestinal enzymes. Diclofenac, omeprazole, dextromethorphan, midazolam, ezetimibe and naloxone served as model substrates for CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A, UGT1A and UGT2B7, respectively. Sensitivity of the method has been challenged by the limited availability of intestinal tissue and its very low microsomal protein content. As proof of concept, enzyme kinetic parameters of pooled human jejunal microsomes have been determined. The findings concerning protein abundance of clinically relevant enzymes along the human intestine contribute to a better understanding of intestinal first pass effect. This knowledge may be helpful in the development of new drug products and for physiologically based pharmacokinetic (PBPK) modeling to estimate the oral bioavailability as well as the interaction potential of an active pharmaceutical ingredient.

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Metadaten
Author: Diana Busch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-34423
Title Additional (English):Characterization of expression and function of metabolic enzymes in human intestinal tissue
Referee:Prof. Dr. Christoph Ritter, Prof. Dr. Henriette Meyer zu Schwabedissen
Advisor:Prof. Dr. Michael Lalk
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/12/17
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/12/13
Release Date:2019/12/17
Tag:Metabolismus, Targeted Proteomics, intestinal
GND Keyword:Darm, Enzyme
Pagenumber:74
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit