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Synthesen modifizierter Nukleoside zur Aufklärung der Struktur und Funktion von RNA-Molekülen

  • Im Fokus dieser Arbeit lagen die Synthesen verschiedener Nukleosidderivate zur Aufklärung der Struktur und Funktion von RNA-Molekülen. Es wurden erfolgreich zwei Adenosinderivate synthetisiert und die für die post-synthetische Markierung benötigte Aminofunktion entweder mit Hilfe der Sonogashira-Kupplung an der Position C2 oder der Heck-Reaktion an der Position C8 eingebaut. Um auch Zugang zu modifizierten Cytidinen zu erhalten, wurde eine Synthesestrategie für ein aktiviertes Uridinderivat entworfen, um dieses nach der chemischen Synthese mittels Phosphoramiditverfahren, während der Reinigung, in das dazugehörige Cytidinderivat umzuwandeln. Hierzu wurden die funktionellen Gruppen erfolgreich für die chemische Oligonukleotidsynthese geschützt, die Modifikation an der Position C5 mit Hilfe der Sonogashira-Kupplung eingebaut und die Position C4 mit Hilfe von TIPS-Cl (2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid) aktiviert. In Vorversuchen konnte die erfolgreiche Umwandlung in das Cytidinderivat experimentell bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss ausgewählter basenmodifizierter Nukleoside auf den Charakter einer doppelsträngigen RNA untersucht. Dazu wurden die Schmelzkurven und Schmelzpunkte modifizierter und unmodifizierter Oligonukleotide gemessen und ausgewertet. Die erhaltenen Daten lassen darauf schließen, dass der Einbau von basenmodifizierten Nukleosiden zur Senkung des Schmelzpunktes führt, jedoch nicht zur Veränderung des doppelsträngigen Charakters. Eine anschließende Markierung eines modifizierten Oligonukleotids mit dem Farbstoff ATTO 680 scheint nur einen marginalen Einfluss auf den Schmelzpunkt, im Vergleich zu den Schmelzpunkten der modifizierten Oligonukleotide, zu haben. Für die Untersuchung der Funktion und Struktur von größeren RNA-Molekülen, wie zum Beispiel ROSE-Elementen, wurde eine Strategie zu deren Herstellung mit Hilfe der T4 RNA Ligase I entwickelt und ex-perimentell bestätigt. Dazu wurde das ROSE-Element in drei Segmente geteilt, diese chemisch synthetisiert, gereinigt und mit Hilfe der T4 RNA Ligase I zum vollständigen Element ligiert. Dabei konnte das ROSE-Element erfolgreich vom 5´-Terminus aufgebaut werden. Es steht nun eine Methode zur Verfügung, um auch modifizierte Oligonukleotide zu einem ROSE-Element zu ligieren und dieses auf seine Funktion und Struktur hin zu untersuchen. Eine RNA 4-way-junction wurde durch Hybridisierung generiert und für strukturelle Untersuchungen verfügbar gemacht.
  • The synthesis of various nucleoside derivatives to elucidate the structure and function of RNA molecules was the main goal of this work. Two adenosine derivatives were successfully synthesized, and the amino function required for post-synthetic labeling was incorporated either by Sonogashira coupling at position C2 or Heck reaction at position C8. Additionally, a synthesis strategy for an activated uridine derivative was designed to have access to modified cytidines. The conversion into the corresponding cytidine derivative takes place after the chemical synthesis of RNA, during the deprotection process. Therefore, the functional groups of the activated uridine derivative were successfully protected for chemical oligonucleotide synthesis. The modification at position C5 was incorporated using the Sonogashira coupling, and position C4 was activated using TIPS-Cl (2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl chloride). In preliminary tests, the successful conversion into the cytidine derivative could be experimentally verified. Furthermore, the influence of selected base-modified nucleosides on the character of a double-stranded RNA was examined. Therefore, the melting curves and melting points of modified and unmodified oligonucleotides were measured and evaluated. The data obtained suggest that the incorporation of base-modified nucleosides leads to a decrease in the melting point, but not to a change in the double-stranded character. Subsequent labeling of a modified oligonucleotide with the dye ATTO 680 seems to have only a negligible effect on the melting point, compared to the melting points of the modified oligonucleotides. To analyze the function and structure of larger RNA molecules, such as ROSE elements, a strategy for their assembly using T4 RNA Ligase I was developed and experimentally verified. Therefore the ROSE element was split into three segments, which were chemically synthesized, purified, and ligated to the complete RNA thermometer using T4 RNA Ligase I. The ROSE element was successfully rebuilt from the 5' terminus. A method is now available to ligate even modified oligonucleotides to a ROSE element and to analyze its function and structure. An RNA 4-way junction was generated by hybridization and made available for structural studies.

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Metadaten
Author: Danilo Springstubbe
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-34981
Title Additional (English):Syntheses of modified nucleosides to elucidate the structure and function of RNA molecules
Referee:Prof. Dr. Sabine Müller, Prof. Dr. Ronald Micura
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/01/22
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/12/18
Release Date:2020/01/22
Tag:RNA, modifizierte Nukleoside, Chemische Synthese
GND Keyword:Chemische Synthese, Nukleoside, RNS
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie