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Four-dimensional in vivo imaging of glomerular morphology and glomerular barrier function in a zebrafish podocyte injury model

  • The global prevalence of kidney diseases has been steadily rising over the last decades. Today, around 10% of the world population suffers from relevant chronic kidney disease. Podocytes are highly specialized and terminally differentiated cells residing in the filtering units of the kidneys, the so-called glomeruli. With their interdigitating foot-processes, these cells are a crucial part of the renal filtration barrier. As podocytes are post-mitotic, injury or loss of these cells results in an impairment of the filtration barrier with subsequent loss of global kidney function. Therefore, the question whether a relevant amount of podocytes can be regenerated and if this regeneration can be influenced is crucial for future therapeutic developments. As in vivo microscopic imaging of podocytes in higher animals like mice or rats is rather challenging, larval zebrafish have been applied as an animal model for podocyte development and kidney filtration. 48 hours post fertilization, zebrafish larvae develop a single filtering glomerulus with a similar morphology and molecular construction to that in mammals. For evaluation of podocyte morphology and filtration, we used transgenic zebrafish strains in which podocytes were labeled with fluorescence proteins. Additionally, podocytes expressed the bacterial enzyme nitroreductase fused to the fluorescence protein mCherry. In this model, application of the antibiotic metronidazole leads to podocyte-specific cell death. Through cross-breeding we established strains that additionally express an eGFP-labeled protein in the blood plasma. Using in vivo two-photon microscopy, we could image podocyte-loss induced impairments of the glomerular filtration barrier. Additionally, we tracked characteristic morphological changes of podocyte morphology including podocyte foot process effacement, development of sub-podocyte pseudocysts and finally detachment of whole cells from the glomerular basement membrane. These changes have been before described histologically in different animal models as well as in patient biopsies. Using the in vivo microscopy approach, we could clearly describe the temporal sequence of these alterations. Finally, we also tracked individual, non-detached podocytes over up to 24 hours, and found that these cells were non-migratory. These results show that early podocyte-regeneration through immigration of intra- or extraglomerular cells is unlikely within the first 24 hours of acute glomerular injury.
  • In den letzten Jahren stieg die globale Prävalenz von Nierenerkrankungen stetig. Heute leiden rund 10% der Weltbevölkerung an relevanter chronischer Niereninsuffizienz. Podozyten sind hochspezialisierte, terminal differenzierte Zellen in den Filtereinheiten der Niere, den sogenannten Glomeruli. Mit ihren interdigitierenden Fußfortsätzen sind diese Zellen ein unverzichtbarer Teil der renalen Filtrationsbarriere. Da Podozyten postmitotisch sind, führen Schädigung oder Verlust dieser Zellen zum Zusammenbruch der selektiven Filtrationsfunktion der Niere mit folgendem globalem Verlust der Nierenfunktion. Daher ist die Frage, ob und wenn ja auf welchem Wege Podozyten regeneriert werden können relevant für künftige Therapieentwicklungen. Unter anderem da die in vivo Beobachtung von Podozyten in höheren Versuchsorganismen schwierig ist wird seit Jahren die Zebrafischlarve als beliebter Modellorganismus für die Podozytenentwicklung und Nierenfiltration genutzt. 48 Stunden nach der Befruchtung entwickeln Zebrafischlarven ein einzelnes filtrierendes Glomerulus mit, im Vergleich zu Säugern, konserviertem histologischen und molekularem Aufbau. Zur Evaluation von Podozytenmorphologie und –funktion nutzten wir transgene Stämme in denen Podozyten durch Fluoreszenzproteine markiert wurden und das Enzym Nitroreduktase exprimierten. Die Applikation des Antibiotikums Metronidazol führt dadurch spezifisch zum Zelltod von Podozyten. Durch Kreuzungen erzeugten wir Stämme, in denen zusätzlich ein eGFP-markiertes Fluoreszenzprotein im Blutplasma als Marker für die Integrität der Filtrationsbarriere exprimiert wurde. Durch in vivo Zwei-Photonenmikroskopie konnten wir dadurch den Verlust der glomerulären Filtrationsbarriere und die charakteristischen Änderungen der podozytären Morphologie in der Podozytenschädigung verfolgen. Diese Änderungen umfassten den Verlust der podozytären Verzweigungen, Entwicklung subpodozytärer Pseudozysten und Ablösung ganzer Zellen von der glomerulären Basalmembran. Diese Veränderungen wurden zuvor histologisch in verschiedenen Tiermodellen und auch Patientenbiopsien beschrieben. Durch den in vivo Mikroskopischen Ansatz konnten wir diese Veränderungen klar in eine zeitliche Abfolge bringen. Zusätzlich verfolgten wir einzelne, verbliebene Podozyten über bis zu 24 Stunden und fanden heraus, dass diese Zellen nicht mobil waren. Diese Ergebnisse machen eine frühe Podozytenregeneration durch Immigration extraglomerulärer Zellen innerhalb der ersten 24 Stunden unwahrscheinlich. 

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Metadaten
Author: Florian Siegerist
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-37677
Title Additional (German):Vierdimensionales in vivo Imaging von glomerulärer Morphologie und Barrierefunktion in einem Zebrafischmodell der akuten Podozytenschädigung
Referee:Prof. Dr. med. Sylvia Stracke, Prof. Dr. med. Hermann Haller
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Nicole Endlich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/05/25
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2020/04/20
Release Date:2020/05/25
GND Keyword:Niere, Zebrafisch, podocyte
Pagenumber:71
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Anatomie und Zellbiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit