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Optimierung industriell-relevanter Bacillus-Spezies

  • Vertreter der Gattung Bacillus werden nicht zuletzt wegen ihrer guten Sekretionsleistung als Expressionswirte in der pharmazeutischen und chemischen Industrie genutzt und stellen eine Alternative zum gramnegativen Bakterium Escherichia coli, Hefepilzen und anderen Organismen dar. Die Art B. licheniformis ist besonders für die Proteaseproduktion geeignet, während B. subtilis zusätzlich als Produktionswirt für die industrielle Herstellung von Wirk- und Zusatzstoffen wie Bacitracin und Riboflavin verwendet wird. Das Genom beider Arten wurde vollständig sequenziert und ermöglicht die Analyse einzelner Gene und deren Funktionen. Um die Effizienz von industriellen Fermentationsprozessen zu erhöhen, können verschiedene genetische Modifikationen hilfreich sein. So kann beispielsweise die Deletion einzelner Gene bzw. Gencluster als auch die heterologe Expression bestimmter Gene zu einer Weiterentwicklung eines Produktionsstammes beitragen und die Vorteile mehrerer Stämme in einem vereinen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit beinhaltet u. a. die Erstellung eines optimierten Wirtssystems. Im Mittelpunkt der dazu durchgeführten Untersuchungen zu B. subtilis standen verschiedene Enzyme des Acetoinstoffwechsels. Es konnte anhand der Überexpression der homologen Xylanase XynA gezeigt werden, dass die Deletion des Operons acoABCL in B. subtilis 6051HGW zu einer verbesserten Autoinduktion des acoA-Promotors führt. Durch einen alsDS-knock out hingegen wird diese verringert. Eine verbesserte Acetoinproduktion des Stammes B. subtilis 6051HGW konnte durch die Expression einer zweiten Kopie der Gene der beiden Untereinheiten einer Acetolactat-Synthase (IlvBH) erreicht werden. Zudem wurde während der stationären Phase ein verbessertes Wachstumsverhalten dieser Mutante auf Minimalmedium beobachtet. Weiterhin wurde das Gen einer putativen Diacetyl-Reduktase aus dem Stamm B. subtilis TU-B-10 untersucht. Dieses Enzym könnte für die Reduktion des nichtenzymatisch entstandenen Metaboliten Diacetyl zu Acetoin verantwortlich sein. Nach Integration des entsprechenden Gens in B. subtilis 6051HGW war jedoch keine erhöhte Acetoinkonzentration im Kulturüber- stand zu messen. B. subtilis 6051HGW LS8PD zeichnet sich u. a. durch seine 8-fache Proteasedefizienz aus. Anhand zweier Modellenzyme wurde die Eignung des Stammes als Expressionswirt heterologer Proteine untersucht. Mit Hilfe eines simulierten fed-batch-Verfahrens konnte das aus dem eukaryotischen Wirt S. cerevisiae stammende Gen sOx in B. subtilis 6051HGW LS8PD erfolgreich exprimiert und in den Überstand sekretiert werden. Nach Expression des Gens einer DnaseI aus Bos taurus konnte das entsprechende Protein extrazellulär dagegen nicht nachgewiesen werden. Andere Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt wurden, beschäftigten sich mit dem Glyoxylatstoffwechsel von B. subtilis 6051HGW. Die Gene des Glyoxylatzyklus sind nicht im Genom von B. subtilis enthalten. Werden sie aus B. licheniformis in B. subtilis6051HGW transferiert, kann der generierte Stamm B. subtilis ACE Überflussmetabolite wie Acetoin oder Acetat für das Wachstum nutzen. Dabei reichert sich jedoch extrazellulär der Metabolit Glycolat an, was möglicherweise zu einer Beeinträchtigung des Glyoxylatzyklus führen kann. Da die Akkumulation von Glycolat in B. licheniformis nicht erfolgt, wurde vermutet, dass die Aktivität der putativen Glyoxylat-Reduktase GyaR dafür verantwortlich ist. Für weitere genetische Modifikationen von B. subtilis ACE war eine Neukonstruktion des Stammes erforderlich. Ein anschließender Transfer des Gens gyaR in B. subtilis konnte die extrazelluläre Glycolatkonzentration jedoch nicht senken. Auch die Deletion von gyaR in B. licheniformis führte nicht zu höheren Konzentrationen dieses Metaboliten. Es kann geschlussfolgert werden, dass das untersuchte Gen gyaR nicht für eine Glyoxylat-Reduktase codiert. Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit der Zellheterogenität von B. licheniformis P300. Das Auftreten von Subpopulationen in einer Bakterienkultur kann zu einem unterschiedlichen Verhalten der einzelnen Zellen und einer verringerten Gesamteffizienz in Produktions- prozessen führen. In Zellkulturen des Stammes B. licheniformis P300 konnten verschiedene Subpopulationen identifiziert werden. Um die genetische Zugänglichkeit zu optimieren, wurden verschiedene Untersuchungen zur natürlichen Kompetenz von B. licheniformis P300 durchgeführt. Zur Vereinheitlichung der während der Kultivierung des Stammes auftretenden Subpopulationen wurden sigD- und sipW-tasA-yqxM-Deletionsmutanten erstellt. Zur Stammkonstruktion kam ein Verfahren zur Anwendung, das clean deletions im Genom erzeugte. Das Protokoll der Kolonie-PCR zur Identifizierung von potentiellen Deletanten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit optimiert. Die generierten Mutanten zeigten im Gegensatz zum Wildtypstamm keine sigD-vermittelte Motilität und Chemotaxis sowie keine tasA-vermittelte Biofilmbildung. Nach Auftrennung der Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation wurden die auftretenden Banden mit denen des Wildtyps verglichen. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion von sigD zur Vereinheitlichung der Subpopulationen führt. Die generierte Mutante wies weiterhin ein verbessertes Wachstum als der Wildtyp und einen veränderten Phänotyp auf, zeigte aber eine verringerte Effizienz bei der Transformation von DNA durch Elektroporation.

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Metadaten
Author:Dipl.-Pharm. Daniel Götze
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-38302
Title Additional (German):Optimization of industrial relevant Bacillus species
Referee:Prof. Dr. Thomas Schweder, Prof. Dr. Thorsten Mascher
Advisor:Prof. Dr. Thomas Schweder
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/07/06
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/01/09
Release Date:2020/07/06
GND Keyword:Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Klonierung, Subpopulation
Pagenumber:157
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften