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Charakterisierung der Nikotinamid-N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom

  • Das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) ist eine von vielen Krebserkrankungen. Viele Patienten weisen eine Mutation im Von-Hippel-Lindau-Gen (VHL) auf und/ oder zeigen eine Überexpression des Enzyms Nicotinamid-N-Metyltransferase (NNMT). Es wurden insgesamt fünf etablierte Zelllinien verwendet, die embryonale Nierenzelllinie HEK-293 und vier ccRCC-Zelllinien (Caki-1, Caki-2, 769-P, 786-O), welche sich in ihrer Expression der Proteine NNMT und VHL unterscheiden. Zudem wurde eine stabile Zelllinie aus den Caki-2 Zellen generiert, die durch ein Doxycyclin induzierbares Tet-On-System NNMT vermehrt exprimiert (C2NNMTs). Es wurden sowohl molekularbiologische als auch biochemische Methoden zur Analyse angewendet. Die Zelllinien wurden für Transfektionsstudien zur Überexpression oder zum Knockdown von NNMT genutzt, um die Einflussnahme auf die Enzyme Nikotinamid-phosphoribosyltransferase (NAMPT), Sirtuin 1 (SIRT1), Methioninadenosyltransferase-2 β-Untereinheit (MAT2B) und Aldehydoxidase (AOX1) zu analysieren. Da SAM (S-Adenosylmethionin) der Methyldonor von NNMT ist, wurde auch der Einfluss der Methioninkonzentration betrachtet. Viele der bisherigen publizierten Versuche wurden bei 100 µM Methionin durchgeführt, was jedoch nicht der humanen Serumkonzentration entspricht, welche bei 20 µM Methionin liegt. Umfangreiche massenspektrometrische Analysen führten zur Identifizierung weiterer Proteine, welche durch die NNMT-Modulation beeinflusst wurden. Die Identifikation einer Vielzahl veränderter Targets verdeutlichte den Einfluss auf den Energiemetabolismus bis hin zur Apoptose. Es zeigten sich unterschiedliche Regulationen von Glykolyse-, Respirations-, Citratzyklus-, Pentosephosphatweg- und Lipidsyntheseproteinen. Insgesamt ergaben sich individuelle, zellspezifische Regulierungen, welche auf die Sirtuine zurückzuführen sind. Weiterhin wurden Untersuchungen zur erhöhten Expression von NNMT unter Einfluss von Nikotinamid (NAM) sowie Interleukin-6 (IL-6) durchgeführt. Die Analysen zeigten, dass zwischen der Pseudohypoxie und der Erhöhung der NNMT-Expression ein Zusammenhang besteht, denn IL-6 phosphoryliert ERK (engl. Extracellular-signal Regulated Kinases) und STAT3 (engl. Signal transducer and activator of transcription 3), welche beide benötigt werden, um die Transkription des NNMT-Gens zu beeinflussen und die NNMT-Proteinexpression zu fördern. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen dazu dienen, die biochemischen Zusammenhänge einer veränderten Expression von NNMT besser zu verstehen und damit neue diagnostische Ansätze zu ermöglichen.
  • Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is one of many cancers. Patients often have a mutation in the Von Hippel-Lindau gene (VHL) and/or show overexpression of the enzyme Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT). Five established cell lines were used for experiments, the embryonic renal cell line HEK-293 and four ccRCC cell lines (Caki-1, Caki-2, 769-P, 786-O), which differ in their expression of the proteins NNMT and VHL. In addition, a stable cell line was generated from the Caki-2 cells, which expresses NNMT by a doxycycline-inducible Tet-On system (C2NNMTs). Analysis was performed by molecular biological and biochemical methods. The cell lines were used for transfection studies on the overexpression or knockdown of NNMT to analyse the influence of the enzymes Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), Sirtuin 1 (SIRT1), Methionine adenosyltransferase 2B (MAT2B) and Aldehyde oxidase (AOX1). Since SAM (s-adenosylmethionine) is the methyl donor of NNMT, the influence of the methionine concentration was also considered. Many of the previously published experiments were performed at 100 µM methionine, which is not the same as the human serum concentration, which is 20 µM methionine. Extensive mass spectrometric analyses led to the identification of further proteins which were influenced by NNMT modulation. The identification of a large number of altered targets revealed the influence on energy metabolism up to apoptosis. Different regulations of proteins of glycolysis, respiration, citrate cycle, pentose phosphate pathway and lipid synthesis were revealed. Overall, individual, cell-specific regulations were found and could be attributed to sirtuins. Furthermore, investigations on the increased expression of NNMT under the influence of nicotinamide (NAM) and interleukin-6 (IL-6) were performed. The analyses showed that there is a correlation between pseudohypoxia and increased NNMT expression, based on IL-6 phosphorylates ERK (Extracellular-signal Regulated Kinases) and STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3), which are required to influence the transcription of the NNMT gene and promote NNMT protein expression. The results of these investigations foster the understanding of biochemical relationships within different expressions of NNMT and thus enable new diagnostic approaches.

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Metadaten
Author: Sina Holstein
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-39217
Title Additional (English):Characterization of Nicotinamide-N-methyltransferase in clear cell renal cell carcinoma
Referee:Prof. Dr. Reinhard Walther, Prof. Dr. Susanne Füssel
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Walther
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/08/20
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/05/18
Release Date:2020/08/20
Tag:Klarzelliges Nierenzellkarzinom, NNMT, VHL
ccRCC
GND Keyword:Karzinom, Niere
Pagenumber:222
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit