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Etablierung eines robusten DNA-Microarray-gestützten Verfahrens zur nicht gerichteten Virusdetektion mit optionaler Kopplung an eine High-Throughput-Sequencing-Technologie

  • Klimawandel, Änderungen der Landnutzung und Habitatzerstörung sowie die Globalisierung tragen zu einer zunehmenden Ausbreitung von bekannten und noch unbekannten Viren bei, die eine Gefahr für Mensch und Tier darstellen können. Um potenziell gefährliche Viren frühzeitig zu entdecken, kann das in dieser Arbeit vorgestellte Protokoll für einen pan-viralen DNA-Microarray-gestützten (PVM) Virusnachweis verwendet werden, der optional mit einer Hochdurchsatzsequenzierung gekoppelt werden kann. Für die Etablierung des PVM-Protokolls wurde die Leistungsfähigkeit von drei Probenbearbeitungs- und Datenauswertungsmethoden beim Nachweis von zwei Modellviren, einem DNA-Virus und einem RNA-Virus, verglichen. Für die Kopplung mit dem PVM wurden verschiedene Systeme für die Hochdurchsatzsequenzierung verwendet. Das Ziel der Arbeit war die Etablierung eines optimierten PVM-Protokolls für einen robusten, breiten Virusnachweis, welcher einzeln oder in Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung als Teil einer mehrstufigen Analysepipeline verwendet werden kann. Beim Nachweis beider Modellviren wies die Library-basierte Probenbearbeitungs- und Datenauswertungsmethode Limma die höchste Sensitivität auf. In der darauf folgenden Validierung konnten alle Viren, unabhängig von ihrer Genomorganisation und Komplexität der Probenmaterialien, korrekt identifiziert werden. In zwei publizierten Studien konnte der Nachweis der zum Zeitpunkt der Untersuchung noch unbekannten BBLV und SqAdV-1 gezeigt werden. Durch die Rückgewinnung von Virus-spezifischen Nukleinsäuren vom PVM und der anschließenden Sequenzierung mittels Hochdurchsatzsequenzierung konnte das SqAdV-1 im Rahmen einer mehrstufigen Analysepipeline vollständig identifiziert, annotiert und taxonomisch eingeordnet werden. Durch die Kombination von PVM und Hochdurchsatzsequenzierung wurden für sechs Viren eine Virus-spezifische Anreicherung und ein damit verbundener Gewinn an Sequenzinformation erreicht. Die Library-basierte Probenbearbeitung mit Limma erlaubte einen robusten und sensitiven Virusnachweis; deshalb wurden beide Methoden für das PVM-Protokoll ausgewählt. Die Fähigkeit des hier etablierten PVM-Protokolls, Viren unabhängig von der Genomorganisation und in komplexen Probenmaterialien zu identifizieren, zeigt dessen Gleichwertigkeit mit bereits etablierten PVM-Systemen. Die Verwendung des PVM-Protokolls in einer mehrstufigen Analysepipeline erlaubt auch die Identifikation von bisher unbekannten Viren. Der durch die Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung erreichte Gewinn an Sequenzinformation ermöglicht eine Identifizierung und detailliertere Charakterisierung von Viren. Der PVM stellt einzeln und in Verbindung mit einem Hochdurchsatzsequenzierungs- System ein wertvolles Werkzeug für die Virusdiagnostik dar, dessen Anwendung den Zeitaufwand für die Virusidentifizierung deutlich reduzieren kann.
  • Climate change, changes in land use, habitat loss and globalization are involved in the increased spread of known and so far unknown viruses that can pose a threat to humans and animals. In order to detect potentially dangerous viruses as early as possible, the protocol of a pan-viral DNA-Microarray (PVM) presented here can be used for DNA microarray-based virus detection, which can be optionally combined with a High-Throughput Sequencing (HTS) system. To establish the PVM protocol, the performance of three sample processing and data evaluation methods have been compared for the detection of two model viruses, one DNA virus and one RNA virus. Different High-Throughput Sequencing systems were used for the combination with the PVM. The aim of this thesis was to establish an optimized PVM protocol for a robust and broad spectrum of virus detection, which can be used individually or in combination with a High-Throughput Sequencing system as a part of a multi-stage analysis pipeline. For the detection of both model viruses, the library-based sample processing and data evaluation method Limma showed the highest sensitivity. In the subsequent validation, all viruses could be correctly identified, regardless of their genome organization and complexity of the sample materials. In two published studies, the detection of BBLV and SqAdV-1, which were still unknown at the time of investigation, could be proved. By recovering virus-specific nucleic acids from PVM and sequencing them using High-Throughput Sequencing, the SqAdV-1 could be identified, annotated and taxonomically classified by using a multi-stage analysis pipeline. The combination of PVM and High-Throughput Sequencing resulted in a virus-specific enrichment and an associated gain in sequence information. The library-based sample processing and Limma provide a robust and sensitive virus detection; both methods were selected for the PVM protocol. The ability of the PVM described here to identify viruses independently of genomic organization and in complex sample materials confirms its similar value as the already established PVM systems. The use of the PVM protocol in a multi-stage analysis pipeline simplifies virus detection, especially of unknown viruses. The gain in sequence information achieved by the combination with a High-Throughput Sequencing system allows a more detailed characterization of viruses. The PVM is a valuable tool for virus diagnostics, either when used individually or in combination with a HTS system, that reduces the time needed for virus detection and characterization.

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Metadaten
Author: Björn Abendroth
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-41819
Title Additional (English):Establishment of a robust DNA microarray-based method for non-directed virus detection with optional coupling to a high-throughput sequencing technology
Referee:PD Dr. rer. nat. Rainer G. Ulrich, Prof. Dr. Dr. Thomas Vahlenkamp
Advisor:Dr. rer. nat. Dirk Höper
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/12/09
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/06/15
Release Date:2020/12/09
Tag:DNA-Microarray, High-Throughput-Sequencing-Technologie, Virusdetektion
GND Keyword:Detection, Mikroarray, Virus
Pagenumber:137
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Zoologisches Institut und Museum
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie