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Identification of molecular detection mechanisms associated with apoptosis induction in response to arenavirus infection

  • New World arenaviruses represent an important group of zoonotic pathogens that pose a serious threat to human health. While some virus species cause severe disease, resulting in hemorrhagic fever and neurological symptoms, other closely related family members exhibit little or no pathogenicity. For instance, Junín virus (JUNV) is the causative agent of Argentine hemorrhagic fever, while the closely related Tacaribe virus (TCRV) is avirulent in humans. Little is known about host cell responses to infection, or how they contribute to virulence; however, TCRV strongly induces caspase-dependent apoptosis (i.e. non-inflammatory programmed cell death) in infected cells, whereas JUNV does not. In order to better understand the connection between apoptosis and pathogenesis, we sought to unravel the regulation of pro- and anti-apoptotic signaling in response to arenavirus infection. We demonstrated that apoptosis induced by TCRV proceeds over the mitochondrial-regulated intrinsic pathway and involves activation of p53 (accumulation and phosphorylation), activation of the pro-apoptotic BH3-only factors Puma and Noxa (accumulation), as well as inactivation of another pro-apoptotic factor called Bad (phosphorylation). The regulation of these factors in response to TCRV infection is accompanied by other classical hallmarks of intrinsic apoptosis, such as disorganization of the mitochondrial network, cytochrome c release, PS flipping, caspase cleavage and nuclear condensation. The involvement of the BH3-only factors as key players in regulating TCRV-induced apoptosis could also be validated in knockout cells, which showed either suppressed or increased apoptosis depending on the respective activation (i.e. Puma and Noxa) or inactivation (i.e. Bad) status of the respective BH3 protein. Interestingly, while JUNV does not trigger late stages of apoptosis induction (i.e. caspase activation, nuclear condensation and cell death), we could show that it activates similar upstream pro-apoptotic signaling events including activation of p53, Puma and Noxa. This supports the current hypothesis that JUNV actively evades the induction of apoptosis through the involvement of a mechanism targeting late steps in the apoptotic cascade. Specifically, this model proposes that intrinsic activation is suppressed at the level of caspase activation by JUNV NP, which serves as an alternative substrate for caspase cleavage. Additionally, in order to identify viral factors associated with the induction of apoptosis, a full genome sequencing of TCRV was performed and contributed to the validation and correction of substantial errors reported in existing sequences for TCRV. With the help of this sequence, correct expression plasmids containing the viral genes for NP, GP and Z were constructed and tested for their ability to induce apoptosis in vitro. This revealed that both TCRV and JUNV Z are triggers for apoptosis, which further supports our finding that JUNV also induces activation of pro-apoptotic factors. Again, consistent with a model where JUNV NP blocks caspase activation directly, co-expression of JUNV Z and NP abrogated caspase activation, while simultaneous expression of TCRV NP and Z still resulted in cell death. Finally, identification of the specific apoptotic factors involved in regulating TCRV-induced apoptosis (i.e. Bad, Puma and Noxa) and the generation of the respective knockout cell lines allowed us to investigate what influence apoptosis induction has on virus infection. Interestingly, knockout of these factors showed no direct impact on virus growth in Vero cells. However, TCRV particles produced in cells with the individual pro-apoptotic (i.e. Puma and Noxa) or anti-apoptotic (i.e. Bad) factors knocked out showed altered infectivity in primary human monocytes and macrophages, which represent important target cells for arenaviruses. Since TCRV particles that originate from the different knockout cells would be expected to contain different amounts of PS in their envelope (depending on the level of apoptosis taking place), this suggests a role of apoptosis in facilitating PS-receptor-mediated entry and/or PS-receptor signaling through downstream kinases, either of which could be contributing to successful infection in professional phagocytic cells. In particular, phosphorylation of some of the identified factors involved in regulating TCRV-induced apoptosis indicates the involvement of upstream kinases from diverse signaling pathways, some of which also play a role in regulating cytokine production – another host cell reaction that differs significantly between TCRV- and JUNV-infected monocytes and macrophages. As such, these findings represent an exciting basis for a possible connection between apoptotic responses and the regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine responses via their associated upstream signaling processes and provide a starting point for future studies that will help us to better understand how these processes contribute to arenavirus pathogenicity.
  • Neuwelt-Arenaviren sind eine wichtige Gruppe zoonotischer Erreger, die eine ernstzunehmende Bedrohung für die Bevölkerung darstellen. Während einige Viren dieser Familie schwerwiegende Krankheitsverläufe im Menschen auslösen können, wie beispielsweise hämorrhagisches Fieber oder neurologischen Symptomen, weisen eng verwandte Arenaviren keine derartige Pathogenität auf. Ein Beispiel hierfür sind das Junín-Virus (JUNV), der Auslöser für Argentinisches hämorrhagisches Fieber und der eng verwandte Prototyp, das Tacaribe-Virus (TCRV), welcher als apathogen für den Menschen gilt. Die zugrundeliegenden Mechanismen für diese fundamentalen Unterschiede im Pathogenitätspotential eng verwandter Arenaviren sind derzeit wenig verstanden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass TCRV eine starke Caspase-abhängige Apoptose-Antwort (nicht-entzündlicher programmierter Zelltod) in infizierten Zellen induziert, wohingegen JUNV diese Reaktion nicht auslöst. Um ein besseres Verständnis über den Zusammenhang zwischen Apoptose-Induktion und der Pathogenese dieser Arenaviren zu erlangen, wurde in dieser Arbeit die Regulation der pro- und anti-apoptotischen Signaltransduktion als Antwort auf eine Infektion mit dem avirulenten TCRV und dem virulenten JUNV näher beleuchtet. Es konnte gezeigt werden, dass die TCRV-vermittelte Apoptose über den mitochondrialen intrinsischen Apoptose-Weg, mit der Aktivierung von p53 (Akkumulation und Phosphorylierung), den pro-apoptotischen BH3-only Faktoren Puma und Noxa (Akkumulation), sowie mit der Inaktivierung eines weiteren pro-apoptotischen Faktors namens Bad (Phosphorylierung), verläuft. Zusätzlich konnte neben der Regulierung dieser Faktoren das Auftreten charakteristischer Merkmale der intrinsische Apoptose-Induktion, wie beispielsweise die Störung des mitochondrialen Netzwerks mit Zytochrom C Ausschüttung, Umverteilung von Phosphatidylserin (PS), Caspase-Spaltung und nukleäre Kondensation, detektiert werden. Die Beteiligung der BH3-only Proteine als Schlüsselfaktoren für die Regulierung der TCRV-induzierten Apoptose konnte ebenfalls in Knockout Zellen bestätigt werden, wobei in den jeweiligen Knockouts entweder eine erhöhte oder reduzierte Apoptose-Antwort gemessen werden konnte, in Abhängigkeit von der entsprechenden Aktivierung (Puma und Noxa) oder Inaktivierung (Bad) der individuellen BH3-only Proteine. Obwohl JUNV interessanterweise keine Aktivierung der spätgeschalteten Apoptose-Schritte (z.B. Caspase-Aktivierung) auslöst, konnte dennoch nachgewiesen werden, dass JUNV eine ähnliche pro-apoptotische Signaltransduktion mit Aktivierung von p53, Puma und Noxa induziert. Dies stützt wiederum eine aktuelle Hypothese in der JUNV einen Mechanismus entwickelt hat um die Induktion der Apoptose aktiv zu umgehen, wobei es gezielt späte Schritte in der Apoptose-Signalkaskade blockieren kann. Konkret beschreibt dieses Modell die Hemmung der Apoptose während der JUNV Infektion auf der Ebene der Caspasen durch die Verwendung und Spaltung des viralen NP, welches als alternatives Substrat für die Caspasen dient um diese abzulenken. Um zusätzlich die viralen Faktoren, die für die Apoptose-Induktion verantwortlich sind ausfindig zu machen wurde eine vollständige Genomsequenzierung für TCRV durchgeführt, welche als Grundlage für molekularbiologische Analysen der Proteinfunktionen diente und dazu beitrug bestehende Fehler in bereits existierenden Sequenzen für TCRV zu validieren und zu korrigieren. Unter Zuhilfenahme der von uns generierten Sequenz konnten korrekte Expressions-Plasmide, welche die viralen Gene für NP, GP und Z beinhalten generiert und getestet werden, wobei die Apoptose-Induktion anschließend gemessen wurde. Diese Transfektions-Experimente enthüllten das Matrixprotein Z von TCRV und JUNV als Auslöser für die Apoptose, was wiederrum die zuvor aufgedeckte Fähigkeit beider Viren, den intrinsischen Weg zu induzieren, bestätigt. In Übereinstimmung mit dem beschriebenen Modell, in dem JUNV Caspase Aktivität mit NP blockieren kann, konnte die Caspase-Spaltung durch die Ko-Expression von JUNV NP und Z aufgehoben werden, während eine Ko-Expression von TCRV NP und Z weiterhin Zelltod auslöste. Letztendlich konnte durch die Identifizierung der spezifischen apoptotischen Faktoren (Bad, Puma und Noxa), die an der TCRV-induzierten Apoptose beteiligt sind und durch die Generierung jeweiliger Knockout-Zellen der Einfluss der Apoptose auf die virale Replikation untersucht werden. Wachstums-Kinetiken zeigten, dass weder eine verstärkte noch eine abgeschwächte Apoptose-Induktion in Vero-Zellen einen Einfluss auf das Wachstum von TCRV hat. Interessanterweise wiesen jedoch TCRV Partikel, die auf den unterschiedlichen Knockout-Zellen angezogen wurden, eine veränderte Infektiosität in primären humanen Monozyten und Makrophagen auf, die wiederum wichtige Zielzellen für Arenaviren darstellen. Da zu erwarten ist, dass TCRV-Partikel, die auf Bad-, Puma- oder Noxa-Knockout Zellen angezogen wurden, unterschiedliche Mengen an PS in ihrer Hülle eingebaut haben (abhängig vom Ausmaß der stattfindenden Apoptose), deutet dies auf eine mögliche Rolle für PS-Rezeptoren und/oder PS-Rezeptor-Signalweiterleitung vermittelt durch diverse nachgeschaltete Kinasen hin, die eine wichtige Rolle während des Eintritts-Mechanismus spielen könnten. Auch die in dieser Arbeit identifizierten Phosphorylierungen der apoptotischen Faktoren deuten auf die Beteiligung vorgeschalteter Kinasen verschiedener Signalwege hin, von denen einige auch eine Rolle bei der Regulierung der Zytokinproduktion spielen - eine weitere Wirtszellreaktion, die sich zwischen TCRV- und JUNV-infizierten Monozyten und Makrophagen deutlich unterscheidet. Demzufolge stellen diese Ergebnisse eine spannende Grundlage für eine mögliche Verbindung zwischen der Regulation der pro- oder anti-inflammatorischen Zytokin-Antwort, und der apoptotischen Signaltransduktion über der damit verbundenen mechanistisch vorgeschalteten Signalkaskade dar, und liefern somit wichtige Anhaltspunkte für weiterführende Studien, die dabei helfen sollen die Prozesse der Arenavirus-vermittelten Pathogenität besser verstehen zu können.

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frontdoor_oas
Metadaten
Author: Julia Holzerland
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-42428
Title Additional (German):Identifizierung molekularer Detektions-Mechanismen assoziiert mit der Apoptose-Induktion als � Antwort auf Arenavirus-Infektion
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, Prof. Dr. Stephan Becker, Prof. Dr. Stephan Günther
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2021/01/11
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/12/10
Release Date:2021/01/11
Tag:Apoptosis, Arenavirus, BH3-only proteins, Junin virus, Tacaribe virus
GND Keyword:Apoptose, Arenaviren, Pathogenität
Pagenumber:160
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie