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Der Einfluss von kaltem Atmosphärendruckplasma auf die Melaninsynthese in humanen Melanozyten

  • Das zur Behandlung von chronischen Wunden zugelassene Plasmagerät kINPen®MED wurde in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich eines möglichen Effektes auf die Pigmentierung der Haut in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst Untersuchungen an Melanomzellen durchgeführt. Verschieden stark pigmentierte Melanomzelllinien wurden einer indirekten Plasmabehandlung ausgesetzt, das heißt mit plasmabehandeltem Zellkulturmedium inkubiert, und der Melaningehalt wurde vor und nach der Behandlung durch eine UVspektroskopische Analyse evaluiert. Im Vergleich zu den unbehandelten Zellen war der Melaningehalt aller getesteten Melanomzelllinien erhöht. Auch im Vergleich zu Zellen, die mit den Positivkontrollen IBMX beziehungsweise NH4Cl / Tyrosin behandelt wurden, zeigte sich ein verstärkter Effekt der Plasmabehandlung auf die Pigmentierung der Melanomzellen. Da Melanomzellen nicht in erster Linie das Ziel von therapeutisch indizierten Beinflussungen der Pigmentierung sind, wurde im nächsten Schritt die Bestimmung des Melaningehaltes von primären Melanozyten nach in vitro-Plasmabehandlung durchgeführt. Dazu wurde zunächst die Methode zur relativen Melaninquantifizierung grundlegend überarbeitet. Es wurden zwei verschiedene Methoden zur verbesserten Melaninanalytik entwickelt, die hinsichtlich der benötigten Probenmenge im Vergleich mit der UV- spektroskopischen Melaningehaltsbestimmung im Melanomzellmodell eine höhere Sensitivität aufweisen. Die erste Methode basiert, wie in der Literatur beschrieben, auf der Oxidation des Melanins in alkalischer Lösung durch Wasserstoffperoxid und anschließender Analyse der melaninspezifischen Abbauprodukte. Die bestehende Methode wurde um eine massenspektrometrische Detektion der Abbauprodukte erweitert, was eine Reduktion der benötigten Probenmenge um den Faktor 10 ermöglichte bei Erhalt der Differenzierungsmöglichkeit zwischen Eumelanin und Phäomelanin. Die Analyse von primären Melanozyten nach indirekter Plasmabehandlung im Vergleich mit unbehandelten Melanozyten ergab eine geringe Steigerung des Eumelaningehaltes in Melanozyten eines stark pigmentierten Spenders, der Phäomelaningehalt blieb unverändert. Der als Positivkontrolle verwendete cAMP-Abbau-Inhibitor IBMX erhöhte sowohl den Eu- als auch den Phäomelaningehalt. Die zweite Methode zur Bestimmung des relativen Melaningehaltes beruht auf der Autofluoreszenz des Melanins, die bei einer Anregungswellenlänge von 785 nm im NIRBereich zu beobachten ist. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie konnte eine Einzelzellanalyse der primären Melanozyten hinsichtlich ihrer Autofluoreszenzintensität durchgeführt werden. Dabei korrelierten die erzielten Ergebnisse der relativen Intensitätsänderung mit denen der massenspektrometrischen Quantifizierung der Melaninabbauprodukte. Gegenüber der unbehandelten Kontrolle war der Melaningehalt nach indirekter Plasmabehandlung geringfügig gesteigert. Nach Behandlung der Zellen mit IBMX als pharmakologischer Positivkontrolle sowie infolge einer Behandlung mit direkter UVStrahlung als physikochemischer Positivkontrolle war jedoch ein stärkerer Effekt auf die Steigerung der Melaninproduktion als bei der indirekten Plasmabehandlung zu beobachten. Die in vitro erhaltenen Ergebnisse konnten auf ein komplexeres Modell übertragen werden, indem eine direkte Plasmabehandlung von Hautproben ex vivo durchgeführt wurde. Außerdem wurde auf diese Weise ein Vergleich zwischen direkter Plasmabehandlung und UVStrahlung neben der unbehandelten Kontrolle möglich. Dazu wurden aus den Hautproben nach Behandlung und anschließender Inkubationszeit Kryoschnitte angefertigt. Um das enthaltene Melanin sichtbar zu machen, wurden die Schnitte einer Silbernitratfärbung unterzogen. Die an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommenen Bilder wurden anschließend mit Hilfe zweier Softwares ausgewertet und die Ergebnisse verglichen. Insgesamt lässt sich trotz starker Schwankung der Ergebnisse beobachten, dass eine wiederholte direkte Plasmabehandlung eine Steigerung der Pigmentierung bewirkt, wenn auch in schwächerem Ausmaß, als dies nach UV-Bestrahlung zu beobachten ist. Insgesamt konnte durch Analyse des Melaningehaltes mit grundlegend unterschiedlichen Methoden wiederholt beobachtet werden, dass eine Plasmabehandlung einen geringen Effekt auf die Pigmentierung humaner Melanozyten ausübt. Dieser Effekt ist bei Behandlungszeiten, wie sie für den kINPen®MED zur Wundbehandlung empfohlen sind, im Vergleich zu einer UVBestrahlung beziehungsweise im Vergleich mit einer pharmakologischen Induktion der Melanogenese deutlich niedriger. Eine Intensivierung der Pigmentierung im Rahmen einer Wundbehandlung ist demnach nicht zu erwarten. Nichtsdestotrotz übt die Plasmabehandlung einen, wenn auch geringen, Effekt auf die Melaninproduktion in der humanen Haut aus. Um etwaige beteilige Enzyme an der gesteigerten Melaninproduktion zu erkennen, wurden Genexpressionsanalysen durchgeführt. Durch die Untersuchung der differenziellen Expression mittels Microarray konnte für 287 annotierte Gene eine Änderungen der Expression festgestellt werden, davon konnten 2 Gene identifiziert werden, für die ein Zusammenhang mit der Pigmentierung beschrieben ist. Veränderte Expressionslevel der hauptsächlich an der Melaninsynthese beteiligten Enzyme wurden durch die Plasmabehandlung der Melanozyten nicht detektiert. Die Untersuchung einiger ausgewählter, an der Melanogenese beteiligter Enzyme mittels qPCR führte zum selben Ergebnis: durch die getesteten Parameter der indirekten Plasmabehandlung wurden keine biologisch relevanten Änderungen des Transkriptionslevels hervorgerufen. In der vorliegenden Arbeit wurde umfassend gezeigt, dass das Medizinprodukt kINPen®MED in den durchgeführten in vitro Tests einen vergleichsweise geringen Effekt auf die Pigmentierung ausübt, der den Positivkontrollen unterlegen ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass der kINPen®MED keinen geeigneten Modulator der Pigmentierung darstellt. Gleichzeitig unterstreichen die Resultate die Unbedenklichkeit der sachgemäßen Anwendung des kINPen®MED an der humanen Haut hinsichtlich etwaiger Melanin-bedingter Veränderungen. Es ist weder eine sichtbare Verstärkung der Pigmentierung noch eine Depigmentierung zu erwarten. Zudem wurde durch die Weiterentwicklung der Methodik im Bereich der Melaninanalytik ein Beitrag zur zukünftigen Testung von Pigmentierungsmodulatoren in Zellkulturmodellen geleistet.
  • The kINPen®MED plasma device, which is approved for the treatment of chronic wounds, was investigated in vitro with regard to a possible effect on skin pigmentation. To this end, investigations were first carried out on melanoma cells. Melanoma cell lines with different levels of pigmentation were exposed to an indirect plasma treatment, that is, incubated with plasma-treated cell culture medium, and the melanin content was evaluated before and after the treatment by means of a UV spectroscopic analysis. Compared to the untreated cells, the melanin content of all tested melanoma cell lines was increased. Also in comparison to cells that were treated with the positive controls IBMX or NH4Cl / tyrosine, an increased effect of the plasma treatment on the pigmentation of the melanoma cells was shown. Since melanoma cells are not primarily the target of therapeutically indicated effects on pigmentation, the next step was to determine the melanin content of primary melanocytes after in vitro plasma treatment. To this end, the method for relative melanin quantification was fundamentally revised. Two different methods for improved melanin analysis have been developed, which have a higher sensitivity with regard to the required amount of sample compared to the UV spectroscopic determination of the melanin content in the melanoma cell model. As described in the literature, the first method is based on the oxidation of melanin in an alkaline solution using hydrogen peroxide and subsequent analysis of the melanin-specific breakdown products. The existing method was expanded to include a mass spectrometric detection of the degradation products, which made it possible to reduce the required amount of sample by a factor of 10 while maintaining the ability to differentiate between eumelanin and pheomelanin. Analysis of primary melanocytes after indirect plasma treatment compared with untreated Melanocytes showed a slight increase in the eumelanin content in melanocytes from a heavily pigmented donor; the pheomelanin content remained unchanged. The as The positive control used cAMP degradation inhibitor IBMX increased both the Eu and the pheomelanin content. The second method for determining the relative melanin content is based on the autofluorescence of melanin, which can be observed at an excitation wavelength of 785 nm in the NIR range. Using flow cytometry, it was possible to carry out a single cell analysis of the primary melanocytes with regard to their autofluorescence intensity. The results obtained for the relative change in intensity correlated with those of the mass spectrometric quantification of the melanin degradation products. Compared to the untreated control, the melanin content was slightly increased after indirect plasma treatment. After treatment of the cells with IBMX as a pharmacological positive control and as a result of treatment with direct UV radiation as a physicochemical positive control, however, a stronger effect on the increase in melanin production was observed than with indirect plasma treatment. The results obtained in vitro could be transferred to a more complex model by performing a direct plasma treatment of skin samples ex vivo. In addition, a comparison between direct plasma treatment and UV radiation in addition to the untreated control was possible in this way. For this purpose, cryosections were made from the skin samples after treatment and the subsequent incubation period. In order to make the contained melanin visible, the sections were subjected to a silver nitrate coloring. The images recorded on a confocal laser scanning microscope were then evaluated with the help of two software and the results compared. Overall, despite strong fluctuations in the results, it can be observed that repeated direct plasma treatment causes an increase in pigmentation, albeit to a lesser extent than is observed after UV irradiation. Overall, by analyzing the melanin content with fundamentally different methods, it was repeatedly observed that plasma treatment had a minor effect on the pigmentation of human melanocytes. With treatment times as recommended for the kINPen®MED for wound treatment, this effect is significantly lower in comparison with UV radiation or in comparison with pharmacological induction of melanogenesis. An intensification of the pigmentation in the context of wound treatment is therefore not to be expected. Nonetheless, plasma treatment has an effect, albeit a small one, on melanin production in human skin. In order to identify any enzymes involved in the increased melanin production, gene expression analyzes were carried out. By examining the differential expression using a microarray, it was possible to determine changes in expression for 287 annotated genes, of which 2 genes were identified for which a connection with pigmentation has been described. Changes in the expression levels of the enzymes mainly involved in melanin synthesis were not detected by the plasma treatment of the melanocytes. The investigation of some selected enzymes involved in melanogenesis by means of qPCR led to the same result: the tested parameters of the indirect plasma treatment did not induce any biologically relevant changes in the transcription level. In the present work it was comprehensively shown that the medical device kINPen®MED has a comparatively small effect on pigmentation in the performed in vitro tests, which is inferior to the positive controls. These results show that the kINPen®MED is not a suitable modulator of pigmentation. At the same time, the results underline the harmlessness of the proper use of the kINPen®MED on human skin with regard to any melanin-related changes. Neither a visible increase in pigmentation nor depigmentation is to be expected. In addition, the further development of the methodology in the field of melanin analysis made a contribution to the future testing of pigmentation modulators in cell culture models.

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Metadaten
Author: Marie-Christine Sommer
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-44161
Title Additional (English):The influence of cold atmospheric pressure plasma on melanin synthesis in human melanocytes
Referee:Prof. Dr. Sebastian Günther, Prof. Dr. Thomas von Woedtke, Prof. Dr. Rolf Daniels
Advisor:Dr. Sybille Hasse
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2021/03/19
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2021/03/15
Release Date:2021/03/19
GND Keyword:Melanin, Pigmentierung, Plasmamedizin
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie