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Pestivirus-Replikons als Werkzeug für heterologe Genexpression und molekulare Charakterisierung

  • Replikons sind autonom replizierende RNA-Moleküle die nicht in der Lage sind, infektiöse Viren zu bilden. Sie sind wichtige Hilfsmittel zur molekularen Charakterisierung von Viren. Außerdem werden sie erfolgreich als Expressionssystem für Proteine und zur Entwicklung von Impfvektoren eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Replikon-basiertes Testsystem für den Nachweis spezifischer Antikörper gegen das atypische porzine Pestivirus (APPV) in Schweineseren etabliert. Auf Basis eines Klons des Virus der bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV) wurden die ursprünglichen BVDV Glykoproteine E1 und E2 gegen die Glykoproteine des APPV ausgetauscht. Die Expression mittels Replikon gewährleistet die natürliche Konformation der Proteine und damit die Bindung der entsprechenden Antikörper. Dieses System ermöglichte die serologische Untersuchung von 1115 Schweineseren ohne vorherige Isolation oder Zellkulturadaptation des Virus. Mit diesem neu entwickelten System konnte eine Seroprävalenzstudie gestartet und eine hohe Prävalenz von APPV in der untersuchten deutschen Schweinepopulation gezeigt werden. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden Replikons zur Charakterisierung des atypischen Pestivirus Bungowannah Pestivirus (BuPV) eingesetzt. Während die Replikons mit Deletionen der Gene für die einzelnen Strukturproteine C, E1 und E2 oder die gesamte Strukturproteinregion keine Besonderheiten im Vergleich zu bereits untersuchten Pestivirus-Replikons aufwiesen und keine infektiösen Virionen mehr produzieren konnten, zeigten BuPV-Replikons mit ERNS-Deletion die Fähigkeit, zwei weitere Replikationszyklen zu durchlaufen und Zellen zu infizieren, allerdings mit einem sehr deutlichen Wachstumsdefizit. Dieser Defekt scheint in der Virusassemblierung und/oder der Freisetzung aus der Zelle zu liegen. Es konnte somit erstmals gezeigt werden, dass ERNS nicht essentiell für die Bildung infektiöser Bungowannah-Viren ist, jedoch sehr wichtig für eine effiziente Virusvermehrung. Diese Eigenschaft der ERNS deletieren BuPV macht diese besonders interessant als Vektoren für die Entwicklung neuer Replikon-basierter Expressionssysteme und einer Vakzinplattform. ERNS-Deletionsmutanten wurden daher auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine effiziente Expression verschiedener immunogener Proteine zu gewährleisten. Die Konstrukte waren dabei in der Lage, die ausgewählten Proteine effizient zu exprimieren und konnten zudem effizient zu Virus-Replikon-Partikel (VRP) verpackt und in einer trans-komplementierenden Zelllinie vermehrt werden. Auch der für das parentale Virus beschrieben Zelltropismus konnte für die generierten BuPV-VRP gezeigt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Eigenschaften sind es der nicht-zytopathogene Charakter und die in den meisten Regionen fehlende Immunität gegen BuPV, die das hohe Potential dieses Systems als universellen Vakzinvektor herausstellen. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein erstes DNA-basiertes System zur Herstellung rekombinanter BuPVs etabliert. Dieses System ermöglicht sowohl die Virusproduktion ausgehend von einem T7-RNA-Polymerase Promotor, als auch von einem Polymerase-II-Promotor. Die infektiösen Viren zeigten gleiche Wachstumseigenschaften wie Viren, welche mit dem konventionellen RNA-System generiert wurden. Auf Basis des neuen DNA-Systems konnte auch ein Replikon mit Deletion im ERNS-Gen etabliert werden. Dieser Klon zeigte nach der Transfektion eine sehr geringe Replikationsrate, konnte jedoch zur weiteren Konstruktion eines „single round infectious particle“ (SRIP) eingesetzt werden. Diese SRIP sind durch die Koexpression des deletierten ERNS in der Lage, sich selbst zu verpacken und bilden damit ein ideales System zum Transport selbst-replizierender RNA. Durch seine selbstlimitierenden Eigenschaften könnte es zur Entwicklung und Etablierung einer effizienten und sicheren Vakzineplattform eingesetzt werden. Allerdings ist dafür eine weiterreichende Optimierung notwendig. Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass sich pestivirale Replikons sowohl als effizientes und schnelles Testsystem für die Untersuchung der Verbreitung neu auftretender Pestiviren, als auch zur Entwicklung effizienter RNA- und DNA-basierter Transport- und Verpackungssysteme viraler Proteine, eignet.
  • Replicons are autonomously replicating RNA molecules incapable of generating infectious virus particles. They are important tools for virus characterization, expression of heterologous genes and for the development of vaccines. In the present study, a new replicon-based test system was established for the detection of antibodies specific for the atypical porcine Pestivirus (APPV). Based on a bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV) clone, the original BVDV glycoproteins E1 and E2 were exchanged for the glycoproteins of APPV. Expression via replicons ensures the natural conformation of the proteins and thus the binding of the corresponding antibodies. This system allowed the serological analysis of 1115 pig sera without prior isolation or cell culture adaptation of the virus. With this newly developed system a seroprevalence study could be started and a high prevalence of APPV was demonstrated in the investigated German pig population. In the further course of this work replicons were used to characterize the atypical pestivirus Bungowannah Pestivirus (BuPV). While replicons with deletions of individual structural proteins C, E1 and E2 or of the entire structural protein region did not show any peculiarities compared to already investigated pestivirus replicons and could not produce infectious virions, BuPV replicons with ERNS deletion (BuPVΔERNS) showed the ability to undergo two further replication cycles and to infect cells, but with a very distinct growth deficit. The ERNS deleted particle showed a clear growth defect compared to the parental virus, which is probably caused by a defect in virus assembly and/or egress. It could be shown for the first time that BuPV-ERNS is dispensable for generating infectious virus particles but seems to be important for virus passaging. This characteristic of ERNS-deleted BuPV makes them particularly interesting as vectors for the development of new replicon-based expression systems and a vaccine platform. BuPVΔERNS mutants expressing immunogenic domains could be efficiently packaged into virus replicon particle (VRP) and were efficiently propagated with a trans-complementing cell line. Furthermore, the same broad cell tropism as for the parental virus could be shown for the newly constructed VRPs expressing different immunogens. Additionally, the non-cytopathic characteristics and the absence of pre-existing immunity to BuPV also provides a significant benefit for the use as a vaccine vector in the future. In addition, a first DNA-based system for the production of recombinant BuPVs has been established in this work. This system allows virus production from both a T7-polymerase- and a Polymerase-II-promoter. Infectious recombinant BuPV could be recovered and had very similar growth characteristics as BuPV generated by conventional reverse genetics. Therefore, also a DNA-based BuPV-replicon with deletions within the ERNS protein were constructed. Although the replicon had a low replication efficiency, it could be used to generate a split genome, co-expressing the deleted protein by a second promotor to form a single round infectious particle (SRIP). These particles are capable of self-packaging and deliver self-replicating RNA into cells but with a very low efficiency. Due to its self-limiting properties it could be used for the development and establishment of an efficient and safe vaccine platform. However, this requires further optimization. In summary, the investigations have shown that pestiviral replicons are suitable both as an efficient and rapid test system for studying the spread of emerging pestiviruses and for the development of efficient RNA- and DNA-based expression/packaging systems and novel vaccine vectors.

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Metadaten
Author: Anja Schumann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-44772
Title Additional (English):Pestivirus replicons a tool for heterologous gene expression and molecular characterization
Referee:Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. Mettenleiter, Prof. Dr. Norbert Tautz
Advisor:Prof. Dr. Martin Beer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2021
Date of first Publication:2021/04/08
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2021/03/11
Release Date:2021/04/08
GND Keyword:Genexpression, Pestivirus, Replikon
Pagenumber:105
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie