Volltext-Downloads (blau) und Frontdoor-Views (grau)

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-45048

Development of whole-cell biocatalysts for the enzymatic hydroxylation of steroids

  • The aims of this thesis were the identification and development of whole-cell biocatalysts for the regio- and stereoselective hydroxylation of steroids, including hormones and bile acids by P450 monooxygenases. Steroids and their derivatives are applied as therapeutic agents. The chemical synthesis of such compounds depends on multi-step procedures, in a stereo- and regiospecific manner involving the protection and deprotection of functional groups and toxic reagents and intermediates. In this thesis, different P450 monooxygenases were investigated as ‘bio-based’ alternatives to chemical catalysts for the late-stage functionalization of steroids and bile acids and engineered by directed evolution procedures towards desired transformation activities. In Article I, the 16α-hydroxylation activity of the bovine CYP17A1 was enhanced by protein engineering to improve the transformation of progesterone into 16α-hydroxyprogesterone in Saccharomyces cerevisiae. Article II follows the same line of research and targets the selective synthesis of bile acid derivatives in Escherichia coli (E. coli) whole-cells. The P450 monooxygenase CYP107D1 (OleP) from Streptomyces antibioticus (S. antibioticus) was identified, which selectively hydroxylates bile acids like lithocholic acid (LCA) and deoxycholic acid (DCA) at the 6β-position, yielding murideoxycholic acid (MDCA), a gallstone solubilizing agent, and 3α-,6β-,12α-trihydroxy-5β-cholan-24-oic acid, respectively. The utilization of OleP as catalyst resulted in shorter synthesis routes for both compounds and additional in a higher yield for MDCA. Building on the results of Article II and the protein engineering approach from Article I, Article III deals with the switch of regioselectivity of the identified CYP107D1 from 6β- to 7β-hydroxylation to form the therapeutic agent ursodeoxycholic acid (UDCA) from LCA by direct hydroxylation. Following a rational protein engineering strategy, a variant with nearly perfect selectivity for UDCA formation was found. Until today, UDCA is either isolated from bile of catheterised farmed bears or produced semisynthetically through low-yielding multistep reactions starting from cholic acid (CA). Article III presents the first reported enzyme for the direct 7β-hydroxylation of LCA to UDCA.
  • Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Entwicklung von Ganzzell-Biokatalysatoren für die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Steroiden, einschließlich Hormonen und Gallensäuren, durch P450-Monooxygenasen. Steroide und ihre Derivate werden als Therapeutika eingesetzt. Die chemische Synthese solcher Verbindungen hängt von mehrstufigen Verfahren in stereo- und regiospezifischer Weise ab, bei denen funktionelle Gruppen sowie toxische Reagenzien und Zwischenprodukte geschützt und entschützt werden. In dieser Arbeit wurden verschiedene P450-Monooxygenasen als „biobasierte“ Alternativen zu chemischen Katalysatoren für die Spätfunktionalisierung von Steroiden und Gallensäuren untersucht und durch gerichtete Evolutionsverfahren auf die gewünschten Transformationsaktivitäten entwickelt. In Artikel I wurde die 16α-Hydroxylierungsaktivität des CYP17A1 durch Protein-Engineering verstärkt, um die Umwandlung von Progesteron in 16α-Hydroxyprogesteron in Saccharomyces cerevisiae zu verbessern. Artikel II folgt der gleichen Forschungsrichtung und zielt auf die selektive Synthese von Gallensäurederivaten in ganzen Zellen von Escherichia coli (E. coli) ab. Die P450-Monooxygenase CYP107D1 (OleP) aus Streptomyces antibioticus (S. antibioticus) wurde identifiziert, die Gallensäuren wie Lithocholsäure (LCA) und Desoxycholsäure (DCA) an der 6β-Position selektiv hydroxyliert und Murideoxycholsäure (MDCA) herstellt bzw. 3α-, 6β-, 12α-Trihydroxy-5β-cholan-24-oic-Säure. Die Verwendung von OleP als Katalysator führte zu kürzeren Synthesewegen für beide Verbindungen und zusätzlich zu einer höheren Ausbeute für MDCA. Aufbauend auf den Ergebnissen von Artikel II und dem Protein-Engineering-Ansatz aus Artikel I befasst sich Artikel III mit der Änderung der Regioselektivität des identifizierten CYP107D1 von 6β- zu 7β-Hydroxylierung zur Bildung des Therapeutikums Ursodesoxycholsäure (UDCA) aus LCA durch direkte Hydroxylierung. Nach einer rationalen Protein-Engineering-Strategie wurde eine Variante mit nahezu perfekter Selektivität für die UDCA-Bildung gefunden. Bis heute wird UDCA entweder aus der Galle von katheterisierten Zuchtbären isoliert oder durch mehrstufige Reaktionen mit geringer Ausbeute ausgehend von Cholsäure (CA) halbsynthetisch hergestellt. Artikel III präsentiert das erste beschriebene Enzym für die direkte 7β-Hydroxylierung von LCA zu UDCA.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar

Statistics

frontdoor_oas
Metadaten
Author: Sascha Grobe
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-45048
Title Additional (German):Entwicklung von Ganzzellbiokatalysatoren für enzymatische Hydroxylierungen von Steroiden
Referee:Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Prof. Dr. Vlada B. Urlacher
Advisor:Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2021
Date of first Publication:2021/04/20
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2021/03/29
Release Date:2021/04/20
GND Keyword:7 beta Hydroxylierung, LCA, OleP, Protein engineering, UDCA
Pagenumber:106
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie