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Zur Rolle des Kationenkanals TRPV4 für den zellulären Ca2+-Spiegel von HEK293 Zellen und der Einfluss des Spinnentoxins GsMTx4

  • Der TRPV4 ist Mitglied einer Gruppe nicht selektiver Kationenkanäle und gehört der Transient-Rezeptor-Potential-Vanilloid Familie an. Neben seiner Bedeutsamkeit für die zelluläre Calciumhomöostase besitzt der Kanal auch eine Permeabilität für Mg2+ und Na+. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentrationen in untransfizierten und in TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen mit dem Calcium-Imaging Verfahren gemessen. Untersucht wurde der Unterschied der Fluoreszenzratio in Ruhe von untransfizierten und TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen, sowie der Einfluss von TRPV4-Agonisten, TRPV4-Antagonisten und des Spinnentoxins GsMTx4 auf die Calciumhomöostase von untransfizierten und TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen. Es konnte nachgewiesen werden, dass ein Großteil der TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen durch eine Überexpression des Kanals, im Vergleich zu untransfizierten HEK293 Zellen, eine deutlich erhöhte Fura-2-Fluoreszenzratio im Sinne eines erhöhten intrazellulären Calciumspiegels [Ca2+]i aufwiesen. Dabei zeigten sich die transfizierten HEK293 Zellen in ihrer Fluoreszenzratio variabel. Sie reichte von nahezu physiologischen Werten, wie sie bei untransfizierten HEK293 Zellen (Fura-2-Fluoreszenzratio etwa 0,4) zu beobachten sind, bis hin zu deutlich erhöhten Werten (Fura-2-Fluoreszenzratio bis >2). Mit den verwendeten selektiven TRPV4-Blockern GSK2193874 und HC067047 konnte die Fura-2-Fluoreszenzratio mit und ohne vorherige TRPV4-Aktivierung gesenkt werden. Auch in Zellen mit einem deutlich erhöhten Ca2+-Spiegel konnte dieser nahezu auf seinen physiologischen Ruhelevel gesenkt werden. Die Fura-2-Fluoreszenzratio von TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen ohne vorherige Aktivierung konnte durch GsMTx4 konzentrationsabhängig gesenkt werden. Bei einer Konzentration von 1µM GsMTx4 war eine relativ geringe, bei 5µM GsMTx4 eine deutliche Absenkung zu beobachten. Nach Aktivierung des TRPV4 durch einen Agonisten konnte das Spinnentoxin GsMTx4 in konzentrationsabhängiger Weise die zellulären Ca2+-Level reduzieren. Bedingt durch seine nicht selektive Wirkung, führt GsMTx4 bei untransfizierten HEK293 Zellen zu einem gewissen Anstieg der Fluoreszenzratio. Dieser Effekt konnte allerdings durch die Zellen kompensiert werden. Welche zelleigenen Mechanismen dies ermöglichten, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Das Spinnentoxin GsMTx4 hat in TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen, in Abhängigkeit seiner Konzentration und einer vorherigen Aktivierung, einen Einfluss auf den intrazellulären Calciumspiegel [Ca2+]i. Bei einer Überexpression des Kanals kommt es zu einer gestörten Calciumhomöostase. Im Hinblick auf den Pathomechanismus von Erkrankungen, welche mit einem erhöhten intrazellulären Calciumspiegel einhergehen, ist eine Beteiligung des TRPV4 durchaus vorstellbar.
  • BACKGROUND The TRPV4 is a member of a group of non-selective cation channels and belongs to the transient-receptor-potential-vanilloid family. In addition to its importance for the cellular calcium homeostasis, the channel also has conducts Mg2+ and Na+. As part of this thesis, the changes in intracellular calcium concentrations in untransfected and TRPV4 transfected HEK293 cells were measured using the calcium imaging method. METHODS The difference in the fluorescence ratio at rest of untransfected and TRPV4 transfected HEK293 cells, as well as the influence of TRPV4 agonists, TRPV4 antagonists and the spider toxin GsMTx4 on the calcium homeostasis of untransfected and TRPV4 transfected HEK293 cells was investigated. RESULTS The majority of the TRPV4 transfected HEK293 cells had a significantly increased Fura-2 fluorescence ratio in the sense of an increased intracellular calcium level [Ca2+]i compared to untransfected HEK293 cells. Transfected HEK293 cells showed a rather variable fluorescence ratio. It ranged from almost physiological values, which were observed in untransfected HEK293 cells (Fura-2 fluorescence ratio about 0.4), to significantly increased values (Fura-2 fluorescence ratio up to >2). Application of the selective TRPV4 blockers GSK2193874 and HC067047, reduced the Fura-2 fluorescence ratio with and without prior TRPV4 activation. Even in cells with markedly increased Ca2+ levels the blockers reduced them to nearly physiological levels. The Fura-2 fluorescence ratio of TRPV4 transfected HEK293 cells without prior activation could be lowered by GsMTx4 in a concentration-dependent manner. At a concentration of 1µM GsMTx4 a relatively small decrease was observed. In contrast, at a concentration of 5µM GsMTx4 a significant decrease was observed. After activation of the TRPV4 in transfected HEK293 cells, the spider toxin GsMTx4 was able to reduce the cellular Ca2+ level in a concentration-dependent manner. CONCLUSION Due to unknown unspecific effects GsMTx4 leads to a slight increase in the fluorescence ratio in untransfected HEK293 cells. This could, however, be compensated by the cells. Further studies could investigate which cellular mechanisms are responsible for the phenomenon. The spider toxin GsMTx4 has an influence on the intracellular calcium level [Ca2+]i in TRPV4 transfected HEK293 cells, depending on its concentration and previous TRPV4 activation. Over-expression of the channel leads to disturbed calcium homeostasis. With regard to the pathomechanism of diseases associated with an increased intracellular calcium level, an involvement of TRPV4 is quite conceivable.

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Metadaten
Author: Christian Sven Johann Kesselring
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-56785
Title Additional (English):On the role of the cation channel TRPV4 for cellular Ca2+ levels in HEK293 cells and the influence of the spider toxin GsMTx4
Referee:Prof. Dr. rer. nat. Heinrich Brinkmeier, PD Dr. med. Friederike Stumpff
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Heinrich Brinkmeier
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2021
Date of first Publication:2021/10/07
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2021/08/09
Release Date:2021/10/07
Tag:GsMTx4; TRPV4
GND Keyword:Calcium, TRP-Kanal
Page Number:91
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pathophysiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit