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Thiol-redox proteomics of Mycobacterium smegmatis in response to ROS, RNS and antibiotics

  • Bacteria are exposed to oxidative stress as an unavoidable consequence of their aerobic lifestyle. Reactive oxygen species (ROS) are generated in the stepwise one-electron reduction of molecular oxygen during the respiration. Pathogens encounter ROS during the oxidative burst of macrophages as part of the host immune defense. Besides ROS, bacteria also have to cope with reactive chlorine, electrophilic and nitrogen species (RCS, RES, RNS). To cope with these reactive species, bacteria have evolved different defense and repair mechanisms. To maintain the reduced state of the cytoplasm, they utilize low molecular weight (LMW) thiols. LMW thiols are small thiol-containing compounds that can undergo post-translational thiolmodifications with protein thiols, termed as S-thiolations. S-thiolations function as major redox regulatory and thiol-protection mechanism under oxidative stress conditions. In eukaryotes and Gram-negative bacteria, the tripeptide glutathione (GSH) functions as major LMW thiol, which is present in millimolar concentrations. The Actinomycetes, such as Mycobacterium and Corynebacterium species do not produce GSH and utilize instead mycothiol (MSH) as their alternative LMW thiol. In Firmicutes, including Bacillus and Staphylococcus species, bacillithiol (BSH) functions as the major LMW thiol. LMW thiols protect protein thiols against the irreversible overoxidation of cystein residues to sulfinic and sulfonic acids. In addition, LMW thiols contribute to the virulence and survival of pathogens, function in metal homeostasis and serve as enzyme cofactors for detoxification of xenobiotics and antibiotics. In this doctoral thesis, we aimed to investigate the roles of MSH and BSH in redox regulation of main metabolic enzymes under oxidative stress in the pathogens Corynebacterium diphtheriae and Staphylococcus aureus. Previous redox proteomics studies identified the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GapDH and the aldehyde dehydrogenase AldA as S-thiolated in S. aureus and C. diphtheriae. Thus, we aimed to study the redox regulation of the metabolic enzyme GapDH in C. diphtheriae in response to NaOCl and H2O2 stress by S-mycothiolation, which is described in chapter 1. Moreover, we studied the involvement of the mycoredoxin-1 (Mrx1) and thioredoxin (Trx) pathways in reactivation of S-mycothiolated GapDH in vitro. Using shotgun proteomics, 26 S-mycothiolated proteins were identified under NaOCl stress in C. diphtheriae. These are involved in energy metabolism (Ndh, GlpD) and in the biosynthesis of amino acids (ThrA, LeuB), purines (PurA) and cell wall metabolites (GlmS). The glycolytic GapDH was identified as conserved target for S-thiolation across Gram-positive bacteria. GapDH was the most abundant protein, contributing with 0.75 % to the total cystein proteome. Moreover, GapDH is a conserved target for redox regulation and S-glutathionylation in response to oxidative stress in several prokaryotic and eukaryotic organisms. Treatment of GapDH with NaOCl and H2O2 in the absence of MSH resulted in irreversible enzyme inactivation due to overoxidation. Pretreatment of GapDH with MSH prior to H2O2 or NaOCl exposure resulted in reversible inactivation due to S-mycothiolation of the active site Cys153. Since S-mycothiolation is faster compared to overoxidation, S-mycothiolation efficiently protects the GapDH active site against overoxidation. The activity of S-mycothiolated GapDH could be restored by both, the Mrx1 and Trx pathway in vitro. Interestingly, the recovery of Smycothiolated GapDH by Mrx1 was faster compared to its reduction by the Trx pathway. In previous studies, the reactivation of S-mycothiolated Mpx and MrsA by the mycoredoxin pathway occurred also faster compared to the Trx pathway, which is consistent with our results. We were further interested to analyze the redox regulation of the glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase Gap of S. aureus under NaOCl and H2O2 stress, which is described in chapter 2. Using the quantitative redox proteomic approach OxICAT, 58 NaOCl-sensitive cystein residues with >10% thiol oxidation under NaOCl stress were identified. Gap and AldA showed the highest oxidation increase of 29% under NaOCl stress at their active site cystein residues. Using shotgun proteomics, five S-bacillithiolated proteins were identified, including Gap, AldA, GuaB, RpmJ and PpaC. Gap contributed with 4 % as most abundant cystein protein to the total cystein proteome. Our activity assays demonstrated that Gap of S. aureus is highly sensitive to overoxidation by H2O2 and NaOCl in vitro in the absence of BSH. The active site Cys151 of Gap was oxidized to the BSH mixed disulfide under H2O2 and NaOCl stress in the presence of BSH in vitro, which resulted in the reversible Gap inactivation. Moreover, inactivation of Gap by NaOCl and H2O2 due to S-bacillithiolation was faster compared to overoxidation, indicating that S-bacillithiolation protects the Gap active site against overoxidation in vitro. We further showed that the bacilliredoxin Brx catalyzes the reduction of S-bacillithiolated Gap in vitro. Molecular docking of BSH into the Gap active site revealed that S-bacillithiolation does not require major structural changes. Apart from Gap, the aldehyde dehydrogenase AldA was identified as S-bacillithiolated at its active site Cys279 under NaOCl stress in S. aureus previously. Thus, the expression, function, redox regulation and structural changes of AldA were analysed under NaOCl and aldehyde stress in S. aureus as summarized in chapter 3. AldA was S-bacillithiolated in the presence of H2O2 and BSH as demonstrated in BSH-specific Western blots in vitro. The expression of aldA was previously shown to be regulated by the alternative sigma factor SigmaB in S. aureus. Transcription of aldA was strongly increased in a SigmaB-independent manner under formaldehyde, NaOCl and diamide stress in S. aureus. Using an aldA deletion mutant, we demonstrated that aldA is required for growth and survival under NaOCl stress in S. aureus. The purified AldA enzyme was shown to catalyze the oxidation of various aldehyde substrates, including formaldehyde, methylglyoxal, glycolaldehyde and acetaldehyde in vitro. In addition, the function of the conserved Cys279 for AldA activity was investigated in vivo and in vitro. The purified AldAC279S mutant was shown to be inactive for aldehyde oxidation in vitro. Moreover, the aldAC279S mutant was very sensitive under NaOCl stress in vivo, and this phenotype could be reversed using the aldA complemented strain. These experiments demonstrate the function of Cys279 for AldA activity both in vitro and in vivo. AldA activity assays showed that AldA is sensitive to overoxidation and irreversible inactivation by H2O2 alone in vitro. In the presence of BSH, AldA is protected against overoxidation by reversible Sbacillithiolation in vitro. Molecular docking and molecular dynamics simulations revealed that BSH occupies two different positions in the Cys279 active site, which depend on the NAD+ cofactor. In the apoenzyme, BSH forms the disulfide with Cys279 in the “resting” state position, while Cys279 is S-bacillithiolated in the “attacking” state position in the holoenzyme in the presence of the NAD+ cofactor.
  • Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verursachen oxidativen Stress in Bakterien und entstehen durch stufenweise Ein-Elektronen-Übertragungen auf molekularem Sauerstoff in der Atmungskette. Pathogene Bakterien sind oxidativen Stress durch die Immunabwehr des Wirts ausgesetzt, wobei ROS durch den oxidativen Burst in Makrophagen und Neutrophilen produziert werden. Neben ROS müssen sich Bakterien auch mit reaktiven Chlor-Spezies (RCS), reaktiven elektrophilen Spezies (RES) und reaktiven Stickstoffspezies (RNS) auseinandersetzen. Um sich gegen reaktive Spezies zu verteidigen, haben Bakterien verschiedene Schutzmechanismen und Reparatursysteme entwickelt. Sie nutzen niedermolekulare Thiolverbindungen um den reduzierten Zustand des Zytoplasmas aufrechtzuerhalten. Niedermolekulare Thiolverbindungen sind an post-translationalen Thiolmodifikationen von Proteinen durch S-Thiolierungen beteiligt. S-Thiolierungen dienen dem Schutz der Thiolgruppen von Cysteinen vor irreversibler Oxidation und regulieren Proteinaktivitäten nach oxidativem Stress. Die niedermolekulare Thiolverbindung Glutathion (GSH) ist ein Tripeptid und kommt in millimolaren Konzentrationen im Zytoplasma von Eukaryoten und Gram-negativen Bakterien vor. Gram-positive Bakterien sind nicht in der Lage, GSH zu synthetisieren und produzieren stattdessen alternative niedermolekulare Thiolverbindungen. Mycothiol (MSH) fungiert als niedermolekulare Thiolverbindung in Actinomyceten, wie z.B. in Mykobakterien und Corynebakterien. In Firmicuten, wie z.B in Bacillus und Staphylococcus-Spezies, wurde Bacillithiol (BSH) als niedermolekulare Thiolverbindung charakterisiert. Neben der Schutzfunktion von Thiolgruppen vor irreversibler Oxidation zu Sulfin- und Sulfonsäuren, sind Bacillithiol und Mycothiol auch an der Virulenz und dem Überleben von pathogenen Bakterien beteiligt. Weiterhin spielen sie eine wichtige Rolle in der Homöostase von Metall-Ionen und als Kofaktor von Enzymen für die Entgiftung von Xenobiotika, Toxinen und Antibiotika. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von MSH und BSH in der Redoxregulation und beim Schutz von NaOCl-sensitiven metabolischen Enzymen unter oxidativem Stress in Corynebacterium diphtheriae und Staphylococcus aureus untersucht werden. Quantiative Redoxproteom-Analysen in C. diphtheriae und S. aureus hatten die Glycerinaldehyd-3Phosphat Dehydrogenase GapDH und die Aldehyd-Dehydrogenase AldA als S-thioliert und stark oxidiert identifiziert. Deshalb habe ich in der Promotionsarbeit die Redoxregulation des metabolischen Enzyms GapDH aus C. diphtheriae durch S-Mycothiolierung als Antwort auf NaOCl und H2O2 Stress in Kapitel 1 biochemisch untersucht. Die Redoxregulation von GapDH aus C. diphtheriae durch Thioredoxin (Trx) und Mycoredoxin1 (Mrx1) wurde weiterhin in dieser Doktorarbeit untersucht. Es wurden im Redoxproteom von C. diphtheriae 26 S-mycothiolierte Proteine nach NaOCl-Stress mittels Shotgun-Proteomics identifiziert. Diese Proteine sind beteiligt am Energiestoffwechsel (Ndh, GlpD), der Biosynthese von Aminosäuren (ThrA, LeuB), Purinen (PurA) und von Zellwandbausteinen (GlmS). Die glykolytische Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GapDH) konnte als konserviertes Target für S-Thiolierungen in C. diphtheriae und S. aureus identifiziert werden. GapDH war mit einem Anteil von 0.75 % das am häufigsten vorkommende Protein im Cystein-Proteom von C. diphtheriae. GapDH ist in Prokaryoten und Eukaryoten ein konserviertes Target für die Redoxregulation durch S-Glutathionylierung nach oxidativem Stress. Die Oxidation von GapDH mittels NaOCl und H2O2 -Stress ohne MSH in vitro führte zur Überoxidation und irreversiblen Inaktivierung von GapDH. In Gegenwart von MSH kam es nach H2O2 und NaOCl-Stress zur reversiblen Inaktivierung von GapDH durch SMycothiolierung in vitro. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die S-Mycothiolierung schneller ablief im Vergleich zur Überoxidation. Detaillierte Enzym-Kinetiken zeigten, dass die S-Mycothiolierung das Cys153 im aktiven Zentrum von GapDH effektiv vor der Überoxidation schützt. Die glykolytische Aktivität von GapDH konnte durch die Reduktion von Smycothioliertem GapDH durch Mrx1 und Trx in vitro regeneriert werden. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die Reduktion von S-mycothioliertem GapDH durch Mrx1 sehr viel schneller erfolgte als durch Trx. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Publikationen zur Reaktivierung von S-mycothioliertem Mpx und MrsA durch Mrx1, welche um 2 Größenordnungen schneller ablief im Vergleich zur Reaktivierung durch das Trx-System. Wir waren weiterhin an der Redoxregulation von Gap aus S. aureus nach NaOCl und H2O2-Stress interessiert, was in Kapitel 2 beschrieben wird. Mittels der Redox-ProteomicsAnalyse OxICAT wurden 58 NaOCl-sensitive Proteine identifiziert und quantifiziert, die im Vergleich zur Kontrolle einen erhöhte Thiol-Oxidation nach NaOCl-Stress aufwiesen. Dabei zeigten die Aldehyd-Dehydrogenasen Gap und AldA eine 29 % erhöhte Oxidation nach NaOCl-Stress in den Cysteinen im katalytischen aktiven Zentrum. Weiterhin konnten die fünf S-bacillithiolierten Proteine Gap, AldA, GuaB, RpmJ und PpaC mittels Shotgun Proteomik in S. aureus identifiziert werden. Dabei ist wiederum Gap das mit 4% am häufigsten vorkommende Protein im Cystein-Proteom von S. aureus. Wir konnten durch biochemische Aktivitätsmessungen zeigen, dass Gap aus S. aureus sehr sensitiv gegenüber Oxidationen durch H2O2 und NaOCl-Stress ist. Die Oxidation von Gap durch H2O2 und NaOCl-Stress ohne BSH führte zur irreversiblen Inaktivierung durch Überoxidation des Cys151 zur Sulfonsäure. In Gegenwart von BSH kam es zur reversiblen Inhibierung der glykolytischen Aktivität von GapDH durch S-Bacillithiolierung, welche schneller ablief im Vergleich zur Überoxidation ohne BSH. Enzymatische Aktivitätsmessungen zeigten, das Cys151 durch S-Bacillithiolierung effektiv vor der Überoxidation geschützt werden kann. Weiterhin konnten wir zeigen, dass das Baciliredoxin Brx eine Reduktion und Reaktivierung von S-bacillithioliertem Gap in vitro katalysieren kann. Durch Kooperation mit Frauke Gräter (Universität Heidelberg) wurde ein molekulares Docking von BSH in das aktive Zentrum von Gap in silico durchgeführt. Das Docking von BSH zeigte, dass die S-Bacillithiolierung von Gap keine großen Strukturänderungen erforderte. Neben dem glykolytischen Enzym Gap wurde die Aldehyd-Dehydrogenase AldA am Cys279 nach NaOCl-Stress im aktiven Zentrum in S. aureus als S-bacillithioliert identifiziert. Deshalb wurde die Expression, Redoxregulation und die strukturellen Änderungen von AldA aus S. aureus nach S-Bacillithiolierung untersucht, was in Kapitel 3 dieser Arbeit beschrieben ist. BSH-spezifische Western-Blots zeigten die S-Bacillithiolierung von AldA nach Oxidation durch H2O2-Stress und BSH in vitro. Das aldA-Gen wird durch den alternativen Sigmafaktor SigmaB in S. aureus reguliert, was bereits früher publiziert worden ist. In NorthernblotExperimenten konnte eine SigmaB-unabhängige Induktion der aldA-Transkription in S. aureus nach Formaldehyd, NaOCl und Diamid-Stress gezeigt werden. Mittels einer aldADeletionsmutante konnte demonstriert werden, dass AldA für das Wachstum und Überleben von S. aureus nach NaOCl-Stress wichtig ist. Aktivitätsmessungen von AldA zur AldehydOxidation konnten die NAD+-abhängige Oxidation von Formaldehyd, Methylglyoxal, Glycolaldehyd und Acetaldehyd in vitro nachweisen. Dies zeigte, dass AldA ein breites Substratspektrum aufweist, wobei das natürliche Aldehyd-Substrat von AldA bisher unbekannt ist. Es wurde weiterhin eine C279S-Mutante erzeugt, um die Funktion des konservierten Cys279 im aktiven Zentrum für die Aktivität von AldA nachzuweisen. Das gereinigte AldAC279S-Protein war katalytisch inaktiv in vitro. Die aldAC279S-Mutante war ebenfalls sensitiv gegenüber NaOCl-Stress in vivo, was durch Komplementation bestätigt werden konnte. In Aktivitätsassays konnte gezeigt werden, dass das gereinigte AldA-Protein sensitiv gegenüber einer Überoxidation durch H2O2 ist und in Gegenwart von BSH S-bacillithioliert wird. Mittels molekularen Dockings und molekular-dynamischen Simulationen wurde durch Kooperation mit Agnieszka Bronowska (University of Newcastle) bestätigt, dass die SBacillithiolierung von AldA am Cys279 keine Strukturveränderungen erfordert, was die Ergebnisse zu Gap bestätigte. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass BSH in zwei verschiedenen Positionen im aktiven Zentrum von AldA lokalisiert ist, was vom NAD+ Kofaktor abhängt. Im Apoenzym ist BSH am Cys279 im „ruhenden“ Zustand lokalisiert, während BSH im Holoenzym die Disulfidbindung mit Cys279 im „aktivierten“ Zustand eingeht. Ähnliche Positionen von BSH im aktiven Zentrum von Cys151 von Gap im ruhenden oder aktivierten Zustand konnten auch in der früheren Docking Analyse bestätigt werden. Zusammenfassend konnte mit AldA ein weiterer Schutzmechanismus von S. aureus gegenüber oxidativem Stress identifiziert werden. Es wird vermutet, dass AldA eine Funktion bei der Entgiftung von toxischem Methylglyoxal oder anderen Aldehyden unter NaOCl-Stress besitzen könnte, was in Folgeanalysen weiter untersucht werden sollte.

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Author:Dr. rer. nat. Marcel Imber
Title Additional (English):Thiol-Redox-Proteomik von Mycobacterium smegmatis als Antwort auf ROS, RNS und Antibiotika
Referee:Prof. Dr. rer. nat. Bruce Morgan
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Haike Antelmann
Document Type:Doctoral Thesis
Year of Completion:2018
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2018/10/22
Release Date:2019/03/11
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften