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Die Rolle von CRMP2 in einem Modell der neuronalen Differenzierung

  • Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) ist ein gut erforschtes Molekül, welches in verschiedenen Geweben, wie z.B. dem zentralen Nervensystem (ZNS), vorkommt. Es wurde bereits gezeigt, dass CRMP2 in den Semaphorin3A-Weg involviert ist. In diesem Signalweg legen wir den Schwerpunkt auf den Redoxstatus von CRMP2. Es bewirkt im reduzierten Zustand eine Aktivierung von Aktinpolymerisation und -quervernetzung, mittels dem Aktin-related-Protein-Komplex (ARP 2/3-Komplex). Diese Regulation des Zytoskeletts ermöglicht das Ausbilden von Axonen und Quervernetzungen und spielt somit eine entscheidende Rolle in der neuronalen Differenzierung. In dieser Arbeit sollte die Rolle des CRMP2 in einem Zellmodell für neuronale Differenzierung näher charakterisiert werden. Als Zellmodell wurden SH-SY5Y-Zellen gewählt, eine dedifferenzierte Neuroblastomazelllinie, die sich zur Untersuchung neuronaler Entwicklungsprozesse eignet. Zunächst wurden initial Versuche zur Validierung einer geeigneten siRNA, für die posttranskriptionelle Genausschaltung von CRMP2 in HeLa-Zellen, durchgeführt. Als Kontrolle diente dabei eine unspezifische Kontroll-siRNA. Nach Validierung wurden die Kontroll-siRNA und die CRMP2-siRNA zur Transfektion von SH-SY5Y-Zellen eingesetzt. Zur Induktion der Differenzierung in einen Neuronen-ähnlichen Phänotyp wurden SH-SY5Y-Zellen mit all-trans Retinsäure (RS) oder Dimethylsulfoxid (DMSO), als Kontrolle, behandelt. Die morphologischen und biochemischen Veränderungen auf Proteinebene zeigten, dass eine Transfektion der SH-SY5Y-Zellen mit siCRMP2 zu einem verlängerten Phänotyp mit stärkerer Quervernetzung führt. Die Analyse der Veränderungen auf Proteinebene mittels Westernblot ergab, dass die Transfektion von SH-SY5Y-Zellen mit siCRMP2, im Vergleich zu Kontrolle- siRNA-transfizierten Zellen, zu einer Zunahme von Molecules interacting with CasL (MICAL1), sowie zu einer Abnahme von cytoplasmic FMR1-interacting protein1 (CyFip1) führte. Beide Proteine sind Bestandteil des Semaphorin3A-Signalweges und somit ebenfalls an der neuronalen Differenzierung beteiligt. Auch eine Beeinflussung der Proteine Aktin und Tubulin, zwei Komponenten des Zytoskeletts, konnte nachgewiesen. Die Transfektion von siCRMP2 führte zu einer Zunahme der Aktin- und Tubulinproteinmengen, im Vergleich zu den siKontrolle-transfizierten Zellen, auch wenn diese nicht mit RS behandelt wurden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Herstellung eines Plasmides zur Expression eines Proteins mit Redoxsensorfunktion in eukarytotischen Zellen. Mit diesem lässt sich in vivo die Verteilung von Glutathion ermitteln. Hierfür wurde die Sequenz, welche das Grx1-roGFP2-Protein kodiert in den Expressionsvektor pExpress eingebracht. Die Sequenzierung der Basenabfolge im Abgleich mit der Referenzsequenz von Tobias Dick, zeigte eine 100%ige Übereinstimmung. Die Transfektion dieses Sensors im Zellmodell war im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich und wird Bestandteil zukünftiger Forschungsarbeiten sein.
  • Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) is a well characterized protein. CRMP2 is expressed in several tissues, e.g. in the central nervous system, and is involved in the Semaphorin3A-signalling pathway. In this pathway we focus on the redoxstate of CRMP2. The reduced form enables the polymerization and interconnection of actin via the actin related protein-complex (ARP 2/3 complex). This regulation process of the cytoskeleton triggers axonal outgrowth and cellular interaction and is therefore crucial for neuronal differentiation. In this thesis we aimed at further characterization of CRMP2 in a cellular model of neuronal differentiation. For this purpose we used SH-SY5Y, a dedifferentiated neuronal blastoma cell line, which is well-suited to examine neuronal processes. At first we tested several siRNAs in HeLa cells regarding a post-transcriptional knock-down of CRMP2 in comparison to an unspecific control siRNA. After validation we transfected SH-SY5Y cells with siCRMP2 and siControl. To induce the differentiation into a neuron-like phenotype, we treated the SH-SY5Y cells with all-trans retinoic acid (RS) or dimethyl sulfoxide (DMSO). DMSO was used as control for RS treatment. The morphological and biochemical changes on protein level revealed that the transfection of siCRMP2 in SH-SY5Y cells induces an elongated and more interconnected cell type. Semi-quantitative western blot analyses showed a higher amount of molecules interacting with CasL 1 (MICAL1) in contrast to a lower amount of cytoplasmic FMR1-interacting protein1 (CyFip1) in siCRMP2 transfected SH-SY5Y cells compared to siControl transfected cells. Both proteins are also part of Semaphorin3A pathway and therefore involved in neuronal differentiation. Further more, we could demonstrate that the transfection has an influence on actin and tubulin amounts. Cells transfected with siCRMP2 showed a higher quantity of actin and tubulin compared to the siControl transfected cells, independently from the treatment with RS. Moreover we planned to construct a vector to express a so called redox sensor, a protein to monitor the glutathione / glutathione disulfide ratio in eukaryotic cells. We therefore cloned the coding sequence of Grx1-roGFP2 into the pExpress vector. A sequence alignment revealed 100% identity to the sequence data of Tobias Dick. However, further experiments with the vector could not. Be performed, as they were yond the time frame of this thesis and will therefore be part of further Research projects.

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Metadaten
Author: Martin Reimann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-32102
Title Additional (German):The role of crmp2 in a model of neuronal differentiation
Referee:PD Dr. med. Nils Kröger, Prof. Dr. rer. nat. Andreas Püschel
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Andreas Püschel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2019/10/02
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2018/07/10
Release Date:2019/10/02
Tag:CRMP2, Neuronale Differenzierung, Redoxplasmid, Transfektion, Zytoskelett
GND Keyword:4121138-8, 4121944-2, 4185874-8
Pagenumber:80
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Urologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit