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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-38841

Identifizierung und Charakterisierung der vom Phosphoproteingen des Newcastle Disease Virus kodierten akzessorischen Proteine W und V

  • Wie andere Vertreter der Paramyxoviridae vergrößert das NDV durch Editierung von Transkripten seine Kodierungskapazität. Durch co-transkriptionelle mRNA-Editierung kodiert das P-Gen beim NDV sowohl für das P-, das V-, als auch das W-Protein. Die drei Proteine gleichen sich N-terminal, wohingegen die C-Termini in Länge und AS-Zusammensetzung variieren. Während sowohl Expression als auch Inkorporation des P- und V-Proteins in das NDV-Partikel nachgewiesen wurde, gab es bisher keinen Beweis für die Existenz des W-Proteins. Für den Nachweis der Expression des NDV W-Proteins wurden W-spezifische Seren auf Grundlage von Peptiden generiert, welche im spezifischen C-Terminus lokalisiert waren und vorhersagbare antigene Regionen beinhalteten. Je eines der Kaninchenseren ermöglichte die Detektion von Plasmid-exprimiertem NDV W-Protein, sowie W-Protein in infizierten Zellen mittels indirekter IF und WB-Analyse. Eine Inkorporation des W-Proteins in NDV-Virionen deuteten WB- und massen-spektrometrische Analysen an, während die Abwesenheit des Proteins für rekombinante NDV deren W-Protein Expression durch unterschiedliche Mutations-ansätze unterbunden wurde, in infizierten Zellen und Viruspartikeln bestätigt werden konnte. Untersuchungen infizierter Zellen mit Hilfe konfokaler Mikroskopie zeigten eine Akkumulation des W-Proteins im Zellkern. Diese Lokalisation wurde auf eine zweigliedrige NLS im spezifischen C-Terminus zurückgeführt und die Funktionalität der NLS anhand der zytoplasmatischen Verteilung des Proteins in transfizierten bzw. infizierten Zellen nach Mutation der zwei basischen Cluster bestätigt. Vergleichende Untersuchungen rekombinanter und WT-NDV zeigten keinen Einfluss der NLS bzw. der Expression des W-Proteins auf die Virusreplikation in vitro. Bei der Analyse wirtsspezifischer, IFN-antagonistischer Funktionen des NDV W-Proteins in der späten Phase der Typ-I-IFN-Antwort mit Hilfe eines Hühnerzell-basierten IFN signaling Assays konnte sowohl für das W-Protein eines lentogenen (NDV Cl30), als auch eines velogenen NDV-Stammes (NDV Herts_I) kein inhibierender Effekt auf den untersuchten Signalweg gezeigt werden. Stattdessen deutete sich für das NDV Cl30 W-Protein ein aktivierender Effekt an. Sequenzanalysen zur Vorhersagbarkeit von W-Proteinen bzw. C-terminal kodierten NLS in NDV-Stämme unterschiedlicher Virulenz und Genotypen ließen keinen Rückschluss auf einen Einfluss des W-Proteins auf die Pathogenität von NDV zu. Im Gegensatz zum W-Protein war die Expression des NDV V-Proteins essentiell für die Replikation von NDV in vitro und in ovo. Für die Analyse des Einflusses von V-Proteinen unterschiedlicher Herkunft auf die Replikation eines lentogenen NDV in vitro wurden diese in verschiedenen rekombinanten Viren von einem zusätzlich inserierten ORF exprimiert und die Expression der homo- und heterologen V-Proteine durch stammspezifische Seren überprüft, wofür im Vorfeld ein NDV R75/95 V-spezifisches Peptidserum generiert wurde. Keines dieser rekombinanten Viren zeigte Replikationsvorteile in vitro im Vergleich zum parentalen Virus. Ein Hinweis auf einen Einfluss der Herkunft des V-Proteins konnte mit Hilfe des Hühnerzell-IFN signaling Assays erhalten werden. Während das V-Protein eines lentogenen NDV (NDV Cl30) keinen inhibierenden Effekt zeigte, deutete sich ein leicht inhibierender Effekt für das velogene NDV Herts_I V-Protein in einer Zelllinie an. Pilotstudien zur potenziellen IFN-antagonistischen Funktion des V-Proteins wurden nach vorheriger Transfektion und Überexpression von V-Proteinen unterschiedlicher Pathotypen bzw. nach Vorbehandlung von Zellen mit Hühner-IFN-α vor Infektion durchgeführt. Die Replikation des korrespondierenden WT-Viruses bzw. rekombinanten Virus mit homo- oder heterologer V-Proteinexpression war in vitro in beiden Fällen nicht verändert.
  • Like other members of the Paramyxoviridae, NDV enlarges its coding capacity by differential editing of transcripts. Due to co-transcriptional mRNA-editing the phosphoprotein gene encodes the phospho- (P), V-, and W protein. The three proteins share a common N-terminus but specify C-termini differing in length and amino acid composition. Whereas the expression and incorporation into NDV particles has been demonstrated for NDV P- and V proteins, evidence for the existence of a W protein was lacking. W-specific antipeptide sera were generated to analyze expression of the NDV W protein based on peptides located in the unique C-terminal W protein amino acid sequence that encompassed predicted antigenic sites. The corresponding rabbit sera enabled the detection of plasmid-expressed W protein as well as W protein expression during infection by indirect immunofluorescence and Western blot analyses. Incorporation of W protein into viral particles was indicated by Western blot and mass spectrometric analyses. In contrast, W protein was absent in infected cells and viral particles of newly generated recombinant NDV lacking W protein expression. Absence of W protein expression was achived by two different mutational approaches. Confocal microscopic analyses revealed a nuclear accumulation of W protein of NDV in infected cells, attributed to a bipartite nuclear localization sequence within its unique C-terminal part. Functionality of the NLS was confirmed by mutation of the two basic clusters leading to redistribution of the W protein to the cytoplasm in transfected and infected cells after. Comparative studies of recombinant and wildtype NDV indicated no influence of the NLS or W protein expression itself on in vitro NDV replication. A potiential host specific IFN-antagonistic function of NDV W proteins in the late phase of the type I-IFN-response was adressed after establishing an IFN-assay based on chicken cell lines. W proteins of either lentogenic (NDV Cl30) or velogenic (NDV Herts_I) NDV strains demonstrated no inhibitory effect on the corresponding signalling pathway. However, a slight activating effect was indicated for the NDV Cl30 W protein. W proteins or presence of C-terminally located NLS are compared for NDV strains of varying virulence and genotype using sequence analyses but allowed for no conclusion about the influence of W proteins on NDV pathogenicity. In contrast to NDV W proteins, V protein is essential for NDV replication in vitro and in ovo. Recombinant viruses with a lentogenic background encoding additional V proteins of variable origin were generated and analysed for their replication behavior in vitro. In comparison to the parental strain none of the recombinant viruses displayed a replicative benefit. The expression of homo- or heterologous V proteins was succesfully confirmed by strain specific sera, including an NDV R75/98 V-specific peptide serum. Analysis of V proteins from differing NDV pathotypes indicated an influence in the chicken cell line IFN-assay. Whereas the V protein of a lentogenic NDV strain (NDV Cl30) demonstrated no IFN-antagonistic effect, the NDV Herts_I V protein inhibited the signaling pathway in a specific cell line. Additionally, a potential IFN-antagonistic function of NDV V proteins was investigated in pilot studies by in vitro replication kinetics. For this purpose, V proteins from varying pathotypes were transfected and overexpressed in cells, or cells were treated with chicken IFN-α before infection. Infection with the corresponding wild type or recombinant viruses expressing a homo- or heterologous V protein respectively displayed no alteration of replication.

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Metadaten
Author: Julia Karsunke
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-38841
Title Additional (English):Identification and characterization of the accessory proteins W and V encoded by the phosphoprotein gene of the Newcastle Disease Virus
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, Prof. Dr. Andrea Maisner
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/07/31
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/06/29
Release Date:2020/07/31
Tag:IFN-Antagonist, V-Protein, W-Protein, mRNA-Editierung
GND Keyword:Geflügel, Newcastle-Krankheit, akzessorische Proteine
Pagenumber:186
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie