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Die Bedeutung der McsB Argininkinase innerhalb der Clp-abhängigen Proteolyse

  • Die McsB Argininkinase spielt in grampositiven Bakterien wie Bazillen, Staphylokokken und Listerien durch die Phosphorylierung von Guanidinogruppen eine gesonderte Rolle innerhalb der Familie der Kinasen. Insbesondere während der bakteriellen Stressadaptation scheint diese Art der posttranslationalen Proteinmodifikation von großer Bedeutung zu sein. Um die Funktionsweise der McsB Kinasefunktion in Verbindung mit dessen McsA Modulatorprotein besser verstehen zu können, wurden konservierte Arginine gegen Lysin substituiert. Auf diese Weise konnten entscheidende intramolekulare Positionen identifiziert werden, die für die Ausbildung der Autokinase- bzw. Phospho-Transferase Aktivität von Bedeutung sind. Diese konnten darüber hinaus in Einklang mit der McsB Struktur (Suskiewicz et al., 2019) gebracht werden. Eines der Zielproteine für die McsB vermittelte Argininphosphorylierung (Arg-P) ist dabei der CtsR Regulator, welcher die Genexpression der Clp-Maschinerie in Bacillus subtilis reprimiert. Mit Hilfe globaler Transkriptomanalysen war es möglich, neben den bereits etablierten Zielgenen auch eine Art fine-tuning Regulation des MhqR Regulons aufzuzeigen. Zwei weitere Proteine, die durch McsB vermittelte Arg-Ps beeinflusst werden, sind der Modulator der generellen Stressantwort, MgsR, und die intrinsisch inaktive Glutamat-Dehydrogenase GudB. Insbesondere GudB fällt durch die Identifikation von 15 Phospho-sites auf, wohingegen lediglich zwei Arg-P Bindungsstellen für MgsR nachgewiesen werden konnten (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2016). Dennoch ist die GudB Stabilität nur geringfügig durch die McsB Kinasefunktion beeinflusst, wohingegen die MgsR Degradation entscheidend durch Arg-Ps beeinflusst scheint. Durch die Substitution der Arginine von MgsR gegen Glutamat wurde eine Art Phospho-Mimikry integriert. So konnten die Auswirkungen auf Regulatoraktivität und Stabilität von MgsR durch mögliche Arg-Ps im Detail untersucht werden. In diesem Zusammenhang wurden durch detaillierte Untersuchungen der MgsR Degradation zusätzliche Informationen zur Funktionsweise von McsB als Adapterprotein gesammelt. Dieses legten die Vermutung nahe, dass McsB nicht nur als ClpC-Adapterprotein fungiert, sondern darüber hinaus auch die ClpX-abhängige Proteindegradation unterstützt.
  • Based on energy-rich phosphorylation of guanidine groups, the arginine kinase takes a special role within the family of kinases in gram-positive bacteria such as Bacillus, Staphylococcus, Listeria or Clostridioides. In B. subtilis, approx. 8.7 % of the proteome was attached by arginine phosphorylation (arg-P) as posttranslational modification (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2014; Trentini et al., 2016; Zhou et al., 2019). The best-examined target protein is the transcriptional regulator CtsR that negatively autoregulates its clpC operon under normal growth conditions (Derré et al., 1999b). Stress induced regulator inactivation is based on different mechanisms, like intramolecular thermoregulatory region, interaction with the McsB adaptor protein and modification by targeted arg-P within DNA binding region (Krüger et al., 2001; Kirstein et al. 2005; Fuhrmann et al., 2009; Elsholz et al., 2010a;). Accordingly, McsB exhibits the regulatory functions as adaptor protein and arginine phosphotransferase. In this work, new details were revealed about the McsB activation as arginine kinase and its impact on different target proteins. Therefore, arginine residues of McsB and its modulator protein McsA were substituted against positively charged lysines. By site-specific mutagenesis, essential positions could be identified for the McsB autokinase and phospho-transferase, respectively. The distinct intramolecular positions were localized in accordance with the recently resolved McsB structure (Suskiewicz et al., 2019). On the other side, also the repressor of mcsB expression, CtsR, was investigated in more detail. Global transcriptional analyses resulted in the identification of a novel gene regulatory finetuning mechanism. In detail, differences in gene expression were observed for MhqR regulated genes in the background of ΔctsR deletion. Further studies revealed DNA binding capabilities of CtsR for the mhqR promoter region and revealed a shortened version of CtsR operator sequence. Interestingly, CtsR seems to act by binding the mhqR promoter as an activator for the corresponding mhqR gene expression. Consequently, the regulatory network of CtsR can be expanded to a positively regulated mhqR gene. Additionally, two further McsB targeted proteins were analysed in detail. The impact of arg-P on protein stability and function was investigated for the modulator of general stress response, MgsR, and the intrinsically inactive glutamate dehydrogenase GudB. Especially GudB exhibits a great number of arg-phospho-sites, whereas only two positions could be identified for MgsR (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2016). Surprisingly, investigations for GudB stability exhibit that McsB dependent destabilisation is independent of the phospho-transferase activity suggesting that a kinase independent McsB function as an adaptor protein plays an important role for degradation. In contrast, kinase function of McsB is a dominant factor for MgsR degradation. Consequently, all MgsR arginine residues were analysed for their influence as putative phospho-site. Therefore, phospho-mimicries (R/E substitutions) were integrated and the corresponding impact on MgsR stability and activity was investigated. Additionally, detailed studies about targeted MgsR degradation suggest that McsB has the potential to act as an adaptor protein of ClpX-ATPase. In general, ClpC is the common interaction partner for McsB dependent degradation. In consequence, new aspects about putative partner switch mechanisms for different target proteins and stress conditions enhance the complexity of the regulatory network for targeted protein degradation in B. subtilis.

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Metadaten
Author: Lars LilgeORCiD
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-39320
Title Additional (English):The role of the McsB arginine kinase within Clp-dependent proteolysis
Referee:Prof. Michael Hecker, Prof. Kürsad Turgay
Advisor:Dr. Ulf Gerth
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/09/03
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/08/17
Release Date:2020/09/03
GND Keyword:Bacillus subtilis, Clp proteolysis, GudB, McsB arginine kinase, MgsR, arginine phosphorylation, stress response
Pagenumber:221
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie