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Mechanismen der Pathogen-Wirt-Interaktion – Störungen der Integrität des Zellverbandes humaner Atemwegsepithelzellen durch das α-Hämolysin von Staphylococcus aureus

  • Staphylococcus aureus, einer der häufigsten Erreger von Pneumonien, Endokardien und Sepsen (Frank et al. 2010), gehört bei nahezu einem Drittel der Bevölkerung zur normalen Nasenschleimhautflora (van Belkum et al. 2009) und kann unter bestimmten Risikobedingungen, vor allem in nosokomialer Umgebung, weiter in die unteren Atemwege vordringen und sich dort vermehren (van Belkum et al. 2009, Ahmed et al. 2015). Da das respiratorische Epithel von einer dicken, viskösen Mukusschicht bedeckt ist (Knowles & Boucher 2002), die Bakterien aufgrund ihrer Größe kaum durchdringen können, liegt die Hypothese nahe, dass es die sehr viel kleineren, löslichen Virulenzfaktoren der Bakterien sind, die den Mukus überqueren und einen ersten Pathogen-Wirt-Kontakt herstellen können. Das lösliche, porenbildende α-Hämolysin (Hämolysin a, Hla) ist einer der Haupt-Virulenzfaktor von S. aureus (Spaulding 2012). Studien hatten gezeigt, dass Hla auch in sublytischer Konzentration zu einer Auflösung der Zell-Zell- (Inoshima et al 2012) und Zell-Matrix-Kontakte (Hermann et al. 2015) humaner Atemwegsepithelzellen führte und so eine Lückenbildung im Zellverband induzierte. In vivo könnten solche Hla-vermittelten Prozesse dazu beitragen, dass eine erste Schädigung des Epithels erfolgt und die Überwindung der epithelialen Barriere für S. aures erleichtert wird. Die vorliegende Arbeit konnte in einem ersten Teil zeigen, dass diese Unfähigkeit von humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o- und S9), nach Inkubation mit rHla den epithelialen Zusammenhalt aufrecht zu erhalten und entstandene parazelluläre Lücken durch aktive Migration zu schließen, auf eine rHla-induzierte Hyperphosphorylierung des fokalen Kontaktproteins Paxillin an Tyrosin 118 (und damit erhöhten Turnover der fokalen Kontakte) und Hypophosphorylierung des Actin-depolymerisierenden Faktors Cofilin an Serin 3 (und damit verstärkten Abbau von Stressfasern) zurückzuführen war. Der Hla-Effekt konnte so in fünf Prüfgrößen quantifizierbar erfasst werden: (1) Verlust des epithelialen Zusammenhalts, (2) Reorganisation des Actinzytoskeletts, (3) Auflösung fokaler Kontakte, (4) Hyperphosphorylierung von Paxillin und (5) Hypophosphorylierung von Cofilin. Im zweiten Teil der Arbeit wurden diese Prüfgrößen herangezogen, um den Mechanismus der Hla-Wirkung genauer aufzuklären. Durch Einsatz einer nichtporenbildenden Mutante rHla-H35L und dem Porenblocker IB201 konnte zunächst gezeigt werden, dass für die schädigenden Effekte auf den epithelialen Zusammenhalt der Zellen Ausbildung einer funktionellen Hla-Pore notwendig war und nicht Bindungsereignisse der Monomere, der Vorpore oder der Pore allein den Hla-Effekt auslösen konnten. Um die porenabhängigen Ereignisse zu untersuchen, wurden Ionenströme durch die Hla-Pore identifiziert und mit Ionomycin (erzeugt einen Calciumeinstrom) und Gramicidin (erzeugt einen Natriumeinstrom und Membrandepolarisierung) nachgebildet. Beide Ionenströme zusammen konnten den Hla-Effekt nahezu vollständig erzeugen. Die Ergebnisse wiesen darüber hinaus darauf hin, dass die Hla-erzeugten ionalen Veränderungen an der Membran unterschiedliche Signalveränderungen in der Zelle vermittelten: Calciumaktivierte Signalwege schienen vor allem für die beobachtete Paxillin-Phosphorylierung verantwortlich zu sein, während ein Natriumeinstrom zu einer Cofilin-Dephosphorylierung führte. Die genaue Signaltransduktion zwischen Einstrom der Ionen und (De-)Phosphorylierungsereignissen erfordert jedoch noch eine genauere Aufklärung. Des Weiteren konnte die Modellierung der Ionenströme den Hla-Effekt nicht komplett nachbilden, sodass wahrscheinlich zusätzliche porenabhängige Signalwege nach Hla-Behandlung (z.B. Verlust von ATP, Baaske & Richter et al. 2016) aktiviert werden.
  • Staphyloccocus (S.) aureus is one of the most prominent pathogens leading to severe pneumonia, endocarditis and sepsis (Frank et al. 2010). Normally, colonizing the nares of about one third of the human population as a harmless commensal (van Belkum et al. 2009), S. aureus is able to penetrate and grow in the lower airways under certain risky condition, namely in nosocomial settings (van Belkum et al. 2009, Ahmed et al. 2015). The human respiratory epithelium in the lower airways is covered by a layer of thick, viscid mucus (Knowles and Boucher 2002), which bacteria are hardly able to pass even in situations of a high bacterial load in the lower airways. Therefore, it is more reasonable that much smaller, soluble virulence associated factors produced by S. aureus pass through the mucus and establish a first pathogen-host-interaction with the human airway epithelial cells. The soluble, poreforming α-hemolysin (hemolysin a, Hla) is one of the main virulence associated factors of S. aureus (Spaulding 2012). Previous studies have shown that sublytic concentrations of recombinant Hla (rHla) induces a dissociation of cell-to-cell (Inoshima et al. 2012) and cell-to-matrix contacts (Hermann et al. 2015) in human airway epithelial cells (16HBE14o- and S9), leading to a formation of paracellular gaps in the cell layer. In vivo, such Hla-mediated processes may initiate a first disturbance of the airway epithelial barrier and facilitate the entrance of S. aureus into the body. In the first part, the present study shows, that the inability of human airway epithelial cells to maintain the integrity of the cell layer and close paracellular gaps after treatment with Hla was due to Hla-induced hyper-phosphorylation of the focal contact protein paxillin at tyrosine 118 (leading to a higher turnover of focal contacts) and hypo-phosphorylation of the actin depolymerizing factor cofilin at serine 3 (leading to an increased depletion of stress fibers). For a quantifiable description of these Hla effects, five test categories were defined: (1) loss of the integrity of the cell layer, (2) reorganization of the actin cytoskeleton, (3) dissociation of focal contacts, (4) hyper-phosphorylation of paxillin, and (5) hypo-phosphorylation of cofilin. These test categories were subsequently used in the second part of the study to investigate the mechanism of action of Hla in more detail. First, using a non-poreforming mutant of Hla, Hla-H35L, and the pore blocking reagent IB201, it became evident that the formation of a functionally active Hla pore was a crucial requirement for Hla to elicit its harmful effects on the integrity of the cell layer of human airway epithelial cells. To study pore-dependent actions of Hla in more detail, possible ion currents were identified and modeled with ionomycin (inducing an influx of calcium) and gramicidin (inducing an influx of sodium and depolarizing the membrane potential). Both modeled ion currents combined were able to generate the effects of Hla almost entirely. Furthermore, the results indicated that these ionic changes mediated by Hla led to different signaling events in treated cells: Paxillin phosphorylation seemed to be mediated by activating calcium dependent signal pathways, whereas an influx of sodium ions resulted in cofilin dephosphorylation. Further investigation is required on how signaling transduction between an influx of ions and these (de)phosphorylation events occurs. In addition, modeling ion influxes did not entirely simulate the effects of Hla, indicating that additional pore-dependent events (i.e. the loss of ATP through the Hla pore, Baaske & Richter et al. 2016) probably account for the distinct effects of Hla.

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Metadaten
Author: Ina Eiffler
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002722-0
Title Additional (English):Mechanisms of Pathogen-Host-Interaction - Effects of α-Hemolysin from Staphylococcus aureus on the Cell Layer Integrity of Human Airway Epithelial Cells
Advisor:Prof. Dr. Jan-Peter Hildebrandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/03/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/02/01
Release Date:2017/03/14
Tag:Actinzytoskelett, Atemwegsepithel, fokale Kontakte
GND Keyword:Hämolysin, Pathomechanismus, Staphylococcus aureus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Zoologisches Institut und Museum
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 590 Tiere (Zoologie)