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Staphylococcus aureus und der Zelltod von humanen neutrophilen Granulozyten

  • Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen, überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt. Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest (Sytox-Assay) und mittels Immunfluoreszenzfärbung analysiert. Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen: (1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft. Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose, Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden. (2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass der Zelltod durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern. Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden basierte.
  • Staphylococcus (S.) aureus is a versatile bacterium presenting as frequent colonizer but also as common pathogen of the human. Furunculosis, a severe skin infection, is mainly caused by S. aureus. Interestingly, the clinical isolates inducing furunculosis frequently harbour the pvl-genes, encoding the toxin Panton-Valentine-Leukocidin (PVL). Even at low concentrations PVL is known to induce the lysis of human neutrophil granulocytes. Neutrophils are essential for the clearance of S. aureus. Besides degranulation and phagocytosis, neutrophils are able to kill microbes by releasing their DNA and antimicrobial peptides to form neutrophil extracellular traps (NETs). Still many questions concerning the interaction between S. aureus and neutrophils remain to be answered. In this work effects of S. aureus on cell death of human neutrophils were characterized, comparing clinical S. aureus isolates from nasal colonization and invasive furunculosis infection. Technically, neutrophils were stimulated with bacterial culture supernatants obtained from exponential or stationary growth phase or with living bacterial cells. DNA release indicating cell death was quantified by exclusively staining extracellular DNA. The morphology of cell death was determined by immune fluorescence. Supernatants from S. aureus caused dose-dependently cell death induction of neutrophils. Surprisingly, stimulation with sublytic concentrations of bacterial supernatants from stationary growth phase extended the life span of neutrophils, while their ability of oxidative burst reaction was conserved. Indirect effects by modulating cytokines of contaminating T cells could be excluded. It is possible that S. aureus persists intracellularly and evades the immune response in this way. Bacterial supernatants from S. aureus isolates from furunculosis patients but not from healthy nasal carriers lysed the neutrophils. This was dependent on the presence of the pvl-genes and on the bacterial culture medium: Only supernatants obtained in nutrient-rich media like CCY contained measurable amounts of PVL and caused necrosis of neutrophils. At sublytic concentrations PVL did not elicit NETosis (neutrophil cell death during NET formation). When exposed to living S. aureus cells, neutrophils died. Depending on the multiplicity of infection rapid DNA release was observed, predominantly necrosis, or delayed cell death, mainly apoptosis or NETosis. However, there were no differences between S. aureus cells from colonizing or furunculosis inducing isolates. In conclusion, this work shows multiple mechanisms, how S. aureus can influence the cell death behaviour of neutrophils: Besides induction of cell death the bacteria secrete factors, which delay the natural apoptosis process of neutrophils, possibly creating an intracellular survival niche. Additionally, the results of this work support the concept of a central role for PVL in necrotizing infections like furunculosis.

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Metadaten
Author: Paula Döring
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001702-7
Title Additional (English):Staphylococcus aureus and the cell death of human neutrophil granulocytes
Advisor:Univ.-Prof. Dr. Barbara Bröker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/02/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/01/30
Release Date:2014/02/11
Tag:Apoptose, NETose, NETs, Neutrophile
NETosis, apoptosis, neutrophils
GND Keyword:Granulozyt, Staphylococcus aureus, Zelltod
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Immunologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit