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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001203-0

Proteolysis at a proteome-wide scale in low GC, Gram-positive bacteria

  • Proteolysis represents the final step in the life of a protein. It is one of the most important cellular processes assisted by chaperone systems and ensures an appropriate protein homeostasis. Protein degradation is essential for the removal of cytotoxic protein aggregates and mis-translated/mal-folded proteins, „unemployed“ and regulatory proteins to enable rapid cell adaptation to altering environmental conditions (Gottesman, 2003; Wiegert & Schumann, 2001; Parker, 1981; Stansfield et al., 1998; Drummond & Wilke, 2008; Goldberg, 1972; Gerth et al., 2008). The bacterial Clp (caseinolytic proteins) protease complexes are analogous to the eukaryotic 26S proteasome and consist of Hsp100/Clp proteins of the AAA+ superfamily and an associated barrel-like proteolytic chamber (e.g. ClpP). The Clp proteases seem to be responsible for the major protein turnover in low GC, Gram+ bacteria. The main goal of this thesis was to develop new methods and tools to investigate global proteolysis more precisely and to get a detailed understanding of protein degradation during starvation conditions and it´s regulation in low GC, Gram-positive bacteria. To analyse protein degradation under starvation conditions the well established glucose starvation model was used. In Bacillus subtilis it could be shown that approximately 200 proteins are selectively degraded in a glucose depletion induced stationary phase. Furthermore radioactive pulse-chase labelling experiments coupled with 2D-PAGE analysis revealed that mainly the ClpCP protease complex is involved in the degradation of proteins in the stationary growth phase. To investigate proteolysis in the human pathogen Staphylococcus aureus in the same way, a newly developed chemically defined medium was established suitable for radioactive pulse-chase labelling experiments under stable glucose starvation conditions. The degradation kinetics of individual 2D spots was significantly better resolved using 14C-BSA as an internal marker protein for the sample normalisation. A rather huge overlap was found within the functional protein classes that were degraded in B. subtilis and S. aureus the stationary phase. Among others, especially proteins involved in amino acid, nucleotide and cell wall biosynthesis were rapidly degraded, whereby not always the same and sometimes another enzymes from a biosynthetic chain were targeted for proteolysis. Despite the resolution power of the 2D-PAGE method, there are some drawbacks such as a limited "protein window" with regard to the molecular weight and isoelectric point, loss of low abundance proteins and a rather low reproducibility for time course experiments. Therefore a mass spectrometry based approach for the simultaneous detection of protein synthesis, accumulation and degradation was developed. This pulse-chase SILAC approach provides a very good reliability with a broad spectrum of proteins that can be analysed. Through the combination with ultracentrifugation even non-soluble and aggregated proteins could be analysed. Several hundred proteins were degraded in S. aureus during glucose starvation. Among them was the functional cluster of ribosomal proteins which is degraded in the early stationary phase. Furthermore proteins belonging to complexes were degraded with the same kinetic (e.g. NrdE, NrdF). In addition selective protein degradation took place according to functional categories (e.g., ribosomal proteins, biosynthetic, glycolytic enzymes) and not to regulatory groups (e.g. CcpA, SigB regulon).The investigation of a clpP deletion mutant in S. aureus revealed a greater susceptibility to aggregation, where the cells try to counteract with the expression of chaperones like GroEL/ES, ClpB and DnaK. The renaturation process is very ATP consuming and only takes place in energy rich phases of growth (e.g. from exponential to transient growth phase). Protein aggregation was found enhanced in the stationary phase. Furthermore, a higher GTP level compared to the wild-type probably resulted in a stronger CodY mediated repression with a rather low level of amino acids in clpP mutant cell. In addition substances like glycerol, which thermodynamically stabilise proteins in refolding processes (Maeda et al., 1996; Feng & Yan, 2008), were found in higher levels compared to the wild-type. A strong response to reactive oxygen species was detected in the clpP mutant strain, which is probably due to ROS production during the early stages of protein aggregation. Altogether, different methods were used for investigation protein degradation at a proteome-wide scale. Hundreds of degradation candidates were identified by gel-based and gel-free approaches in S. aureus wild-type cells. “Unemployed” proteins (e.g. ribosomal proteins, biosynthetic enzymes) were degraded and proteins particularly required and synthesized in glucose-starved cells such as TCA cycle enzymes were stable in the stationary phase. Investigation of the clpP mutant strain supports a proposed model for the pleiotropic phenotype and provides a deeper insight in the fine-tuned protein quality control and the important role of ClpP during starving conditions.
  • Die Proteolyse stellt die letzte Stufe im Leben eines Proteins dar. Sie ist ein wichtiger zellulärerer Prozeß und sorgt im Zusammenspiel mit dem Chaperon-System für eine Proteinhomöostase. Die Degradation von Proteinen ist essentiell für den Abbau von zytotoxischen Proteinaggregaten sowie von falsch synthetisierten bzw. falsch gefalteten Proteinen und für den schnellen Abbau von „arbeitlosen“ sowie regulatorischen Proteinen, um vor allem eine schnelle Anpassung an sich verändernde Umweltbedingungen zu gewährleisten (Gottesman, 2003; Wiegert & Schumann, 2001; Parker, 1981; Stansfield et al., 1998; Drummond & Wilke, 2008; Goldberg, 1972; Gerth et al., 2008). Der bakterielle Clp-Protease-Komplex (caseinolytische Protease ) ist strukturell analog zum eukaryontischen 26S Proteasom und besteht aus HSP100/Clp Proteinen der AAA+ - Familie und einer interagierenden tonnenförmigen proteolytischen Kammer (z.B. ClpP). Die Clp Proteasen scheinen für den globalen Proteinabbau in Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt verantwortlich zu sein. Das Hauptziel dieser Arbeit war es neue Methoden zur Untersuchung der globalen Proteolyse zu entwickeln, um ein besseres Verständnis zum Proteinabbau in hungernden Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis Zellen zu bekommen. Dafür wurde das gut etablierte Glucose-Hunger-Modell verwendet. In Bacillus subtilis konnte gezeigt werden, dass etwa 200 Proteine in Glucose-hungernden, stationären Zellen selektiv abgebaut werden. Radioaktive pulse-chase Experimente gefolgt von einer 2D-Gelelektrophorese ergaben, dass vor allem der ClpCP-Protease-Komplex für diesen Abbau zuständig ist. Um den Proteinabbau beim humanpathogenen Erreger Staphylococcus aureus in gleicher Weise zu untersuchen, wurde ein chemisch definiertes Medium etabliert, das für pulse-chase Experimente geeignet ist und eine stabile, durch Glucose-Hunger induzierte, stationäre Phase gewährleistet. Dabei konnte u.a. festgestellt werden, dass die Proteinabbaukinetiken der einzelnen 2D-Gel-Proteinspots quantitativ und signifikant besser werden durch die Verwendung von radioaktiven 14C-Rinderserumalbumins als internes Markerprotein zur Proben-Normalisierung. Überraschend war, dass es eine große Überlappung in den funktionalen Proteinklassen hinsichtlich des Proteinabbaus in B. subtilis und S. aureus gab, wenngleich nicht immer die gleichen und manchmal andere Enzyme abgebaut wurden. Unter anderem wurden vor allem Proteine die an der Aminosäure, Nukleotid- und Zellwand- Biosynthese beteiligt sind zügig unter Nichtwachs-tumsbedingungen in der stationären Phase abgebaut. Trotz der hohen Proteinspot-Auflösung bei der 2D-Gelelektrophorese besitzt diese Technik auch einige Nachteile, wie ein durch Molekular-gewicht und isoelektrischen Punkt begrenztes „Proteome-Fenster“ und eine eher geringe Re-produzierbarkeit. Aus diesen Gründen wurde ein Massenspektrometrie orientierter Ansatz ent-wickelt, der die simultane Untersuchung von Proteinsynthese, Proteinakkumulation und Protein-abbau möglich macht. Der sogenannte pulse-chase SILAC Ansatz ermöglicht es, ein sehr breites Proteinspektrum mit hoher Reproduzierbarkeit zu untersuchen. Durch Ultrazentrifugation konnten lösliche und unlösliche/aggregierte Proteine analysiert werden. Es wurden mehrere hun-dert Proteinabbaukandidaten in Glucose hungernden S. aureus Zellen identifiziert. Unter ihnen befand sich auch der funktionale Cluster der ribosomalen Proteine, welcher schon in der frühen stationären Phase abgebaut wird. Darüber hinaus wiesen Proteine die im funktionalen Komplex zusammenwirken eine gleiche Proteinabbaukinetik auf (z.B. NrdE, NrdF). Zudem erfolgt die selektive Proteindegradation nach funktionellen Clustern (z.B. ribosomale Proteine, biosynthe-tische Proteine, glykolytische Enzyme) und nicht nach Regulator-zugehörigen Clustern (z.B. CcpA-, SigB-Regulon). Die Untersuchung der clpP Deletionsmutante in S. aureus ergab ein starkes Proteinaggregationspotential speziell in der stationären Phase, wobei die Zellen versuchen durch erhöhte Expression der Chaperone GroEL/ES, ClpB und DnaK diesem Prozess entgegen zu wirken. Da eine Protein-Renaturierung für die Zelle sehr energieaufwendig ist, findet sie nur in energiereichen Phasen des Wachstums statt (z.B. exponentielle bzw. transient Phase). Darüber hinaus konnte eine höhere GTP Konzentration bezogen auf die relative CodY-Proteinmenge in der clpP Mutante gegenüber dem Wildtyp gemessen werden, was zu einer verstärkten Repression des CodY-Regulons in der clpP Mutante führt. Dies erklärt auch das niedrige Niveau von intra-zellulären Aminosäuren in der clpP Mutante. Zudem wurden Substanzen wie Glycerin, das thermodynamisch stabilisierend und unterstützend auf die Protein-Renaturierung wirkt (Maeda et al., 1996; Feng & Yan, 2008), in größeren Konzentrationen in den clpP-Mutanten Zelle gefunden. Desweiteren wurde eine starke zelluläre Antwort auf oxidativen Stress in der clpP Mutante detektiert, die wahrscheinlich durch die in den frühen Phasen der Proteinaggregation auftretenden reaktiven Sauerstoff Spezies induziert wurde. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass hunderte Proteinabbaukandidaten durch Gel-basierte und Gel-freie Ansätze in S. aureus identifiziert wurden. Dabei ist auffällig, dass insbesondere „arbeitslose“ Proteine (z.B. ribosomale Proteine, biosynthetische Enzyme) in der stationären Phase abgebaut werden, wobei Enzyme die gebraucht und synthetisiert werden (z.B. TCA Zyklus Enzyme) sich stabil verhalten. Die Ergebnisse aus den Untersuchungen mit der clpP Mutante unterstreichen die wichtige Rolle von ClpP in der Zelle und liefern Hinweise zur Erklärung des pleiotropen Phänotyps der Mutante.

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Metadaten
Author: Stephan Michalik
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001203-0
Title Additional (German):Proteolyse auf Proteome-weiter Ebene in niedrig GC-haltigen, Gram-positiven Bakterien
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/03/28
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/03/16
Release Date:2012/03/28
GND Keyword:Proteolyse, Staphylococcus aureus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie