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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000543-6

Physiologische und funktionelle Charakterisierung von kardiodepressiven Substanzen aus dem post-ischämischen, reperfundierten Rattenherzen

  • Wird nach einer ischämischen Phase, in der Herzmuskelgewebe vorübergehend mit Sauerstoff und weiteren Nährstoffen pathologisch bedingt unterversorgt wird, die Durchblutung des Gewebes wiederhergestellt (Reperfusion), finden auf zellulärer Ebene komplexe Signaltransduktionsmechanismen statt, die entweder für das Gewebe schädlich sein können („Ischämie-Reperfusionsschaden“) oder das Herzmuskelgewebe vor weiteren Schädigungen schützen (Kardioprotektion). Felix et al. gaben Hinweise auf während der frühen Reperfusion freigesetzte Substanzen in post-ischämischem Effluat, die den Calciummetabolismus von isolierten adulten Rattenkardiomyozyten beeinflussen und in Folge die Kontraktilität reduzieren (Felix et al. 2001). Ziel der Arbeit war es, die Signalwege zu identifizieren, die negativ-inotrop auf isolierte Kardiomyozyten wirken, um letztendlich Rückschlüsse auf die Identität der Mediatoren im Effluat ziehen zu können. Experimentelle Vorarbeiten gaben Hinweise darauf, dass die negativ-inotropen Mediatoren des Effluates aus dem Arachidonsäure-Stoffwechsel freigesetzt werden. Daher wurde in der Arbeit die Rolle des Cyclooxygenase- und Prostaglandin-Metabolismus bei der Vermittlung des negativ-inotropen Effekts von post-ischämischem Effluat auf isolierte Kardiomyozyten untersucht. Nach 10 min globaler „stop-flow“-Ischämie wurden Herzen adulter Ratten reperfundiert und das Koronareffluat über 30 s gesammelt. Die Effekte dieses post-ischämischen Effluates auf die Zellkontraktion (systolische Zellverkürzung) und den Calciumstoffwechsel (Calciumtransienten) wurden mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie an elektrisch stimulierten, laminierten und mit Fura-2AM gefärbten adulten Rattenkardiomyozyten analysiert. Als Kontrolle wurde Effluat aus der Perfusion vor der Ischämiephase verwendet. Die vorliegende Untersuchung analysierte die Rolle der Cyclooxygenase und von Prostaglandin-Rezeptoren in der Signaltransduktion der negativ-inotropen Faktoren durch Anwendung verschiedener Inhibitoren und Antagonisten. Die Expression der Cyclooxygenase-Isoformen und der verschiedenen Prostaglandin-Rezeptoren wurde mittels Western Blot und Immunfluoreszenzfärbungen untersucht. Laminierte und mit Fura-2AM gefärbte adulte Kardiomyozyten exprimierten beide Isoformen der Cyclooxygenase. Die Expression der Stress-induzierten Cyclooxygenase-2 war in laminierten Kardiomyozyten im Vergleich zu nicht-laminierten Kardiomyozyten erhöht. Adulte Rattenherzen exprimierten auf niedrigem Level basal die Cyclooxygenase-2. Eine 10-minütige Ischämiephase führte nicht zu einer Verstärkung der Expression. Durch Vorinkubation der Zellen mit dem Cyclooxygenase-Inhibitor Indomethacin und den Cyclooxygenase-2-Inhibitoren NS-398 und Lumiracoxib wurde der negativ-inotrope Effekt von post-ischämischem Effluat auf Calciummetabolismus und Kontraktilität gehemmt. Der Cyclooxygenase-1-Inhibitor SC-560 hingegen beeinflusste die Effekte des post-ischämischen Effluates nicht. Post-ischämisches Effluat reduzierte in autonom kontrahierenden neonatalen Kardiomyozyten wie in adulten Zellen den Calciumtransienten und wirkte außerdem reprimierend auf die Schlagfrequenz. Die reduzierende Wirkung auf beide Parameter konnte durch Anwendung von Indomethacin, NS-398 und Lumiracoxib blockiert werden. Im Western Blot konnten in isolierten Kardiomyozyten Rezeptoren für Prostaglandin D (DP1 und DP2), E (EP1-EP4), I und Thromboxane nachgewiesen werden. Durch die Anwendung selektiver Prostaglandin-Rezeptor-Antagonisten konnte der Signaltransduktionsmechanismus „downstream“ der Cyclooxygenase-2 auf die Rezeptoren EP2 und EP4 eingegrenzt werden. Der Effekt von post-ischämischem Effluat ist außerdem Proteinkinase A-abhängig. Die Ergebnisse der Experimente mit dem Proteinkinase A-Inhibitor Rp-cAMPS stehen im Einklang mit den cAMP-Analysen von Lysaten adulter Kardiomyozyten, die mit post-ischämischem Effluat vorbehandelt wurden und im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte cAMP-Konzentration aufwiesen. Die negativ-inotrope Wirkung von post-ischämischem Effluat zeigt eine kardioprotektive Funktion der post-ischämisch freigesetzten Substanzen an. Die Wirkung des Effluates konnte durch Anwendung des Inhibitors für sarkolemmale und mitochondriale Kalium(ATP)-Kanäle Glibenclamid und des für sarkolemmale Kalium(ATP)-Kanäle selektiven Inhibitors HMR-1098 aufgehoben werden. Außerdem wurde die Wirkung des post-ischämischen Effluates auf Kardiomyozyten in extrazellulärem Milieu mit erhöhter Calciumkonzentration untersucht. Im Unterschied zur Kontrolle verminderte das post-ischämische Effluat den intrazellulären diastolischen und systolischen Calciumanstieg. Bei den Mediatoren im post-ischämischen Effluat handelt es sich vermutlich um Substanzen aus dem Arachidonsäuere-Stoffwechsel, die in isolierten Kardiomyozyten durch die Cyclooxygenase-2 umgesetzt werden und über EP2-/EP4-Rezeptoren durch die Aktivierung von sarkolemmalen Kalium(ATP)-Kanälen negativ-inotrop und kardioprotektiv wirken.
  • When the myocardium is reperfused after an ischaemic phase in which tissue is restricted in supply of oxygen and other nutrients complex signal transduction processes occur in the cells that damage (ischaemic-reperfusion damage) or protect the myocardium from further damage during reperfusion (cardioprotection). Felix et al. gave evidence of substances in the post-ischaemic effluent which are released during reperfusion and influence calcium metabolism in isolated adult cardiomyocytes and therefore reduce contractility of the cells (Felix et al. 2001). The aim of the study was to identify the signal transduction pathways leading to the negative inotropic effect on the isolated cardiomyocytes in order to draw conclusions on the identity of the mediators in the effluent. Experiments indicated that the negative inotropic mediators of the effluent are released from the arachidonic acid metabolism. Therefore in the present study the role of cyclooxygenase- and prostaglandin-metabolism was investigated in mediating the negative inotropic effect of the post-ischaemic effluent on the isolated cardiomyocytes. After 10 minutes of global stop-flow ischaemia adult rat hearts were reperfused and the coronary effluent was collected over a period of 30 seconds. The effect of the post-ischaemic effluent on the contractility (systolic cell shortening) and the calcium metabolism (calcium transient) of field-stimulated and laminated cardiomyocytes that were stained with fura-2AM was analysed by fluorescence microscopy. Effluent collected before the ischaemic phase was used as a control. The present study analysed the role of cyclooxygenase and prostaglandin receptors in the signaltransduction of the negative inotropic factors by using various inhibitors and antagonists. The expression of the cyclooxygenase-isoformes and the various prostaglandin receptors was analysed by Western Blot and immunofluorescence staining. Laminated and fura-2AM-stained cardiomyocytes expressed both isoformes of cyclooxygenase in adult cardiomyocytes. The expression of stress-induced cyclooxygenase-2 in laminated cardiomyocytes was increased in comparison to cardiomyocytes that were not laminated. Adult rat hearts basally expressed cyclooxygenase-2 at a lower level. 10 minutes of global ischaemia did not influence the expression in the hearts. Pre-incubation of cells with the cyclooxygenase-inhibitor indomethacin and the cyclooxygenase-2-inhibitors NS-398 and lumiracoxib inhibited the negative inotropic effect of the post-ischaemic effluent on calcium metabolism and contractility of the isolated cardiomyocytes. The cyclooxygenase-inhibitor SC-560 however did not influence the effect of the post-ischaemic effluent. The post-ischaemic effluent reduced calcium transients and beating frequency in neonatal cardiomyocytes. The reducing effect on both parameters was also blocked by the use of indomethacin, NS-398 and lumiracoxib. In isolated cardiomyocytes receptors of prostaglandin D (DP1 and DP2), E (EP1-EP4), I and thromboxanes were detected by Western Blot analysis. By the use of selective prostaglandin receptor-antagonists there was shown that the mechanism of signaltransduction downstream of cyclooxygenase-2 is probably mediated by the prostaglandin E-receptors EP2 and EP4. The effect of the post-ischaemic effluent is furthermore dependent on protein kinase A. The results of experiments with the protein kinase A-inhibitor Rp-cAMPS were confirmed by cAMP-analysis of lysates of isolated adult cardiomyocytes that were treated with the post-ischaemic effluent and that show an increased concentration of cAMP. The negative inotropic effect of the post-ischaemic effluent indicates a cardioprotective function of the post-ischaemically released substances. The effect of the effluent was blocked by the use of glibenclamide and HMR-1098 which are inhibitors of sarcolemmal and mitochondrial potassium (ATP)-channels. Furthermore the effect of the post-ischaemic effluent on cardiomyocytes was investigated when extracellular calcium is increased. In comparison to the control effluent the post-ischaemic effluent reduced the intracellular diastolic and systolic calcium increase. The mediators in the post-ischaemic effluent are probably substances released from arachidonic acid metabolism that were metabolised by cyclooxygenase-2 in isolated cardiomyocytes and act negative inotropic and cardioprotective by activating of sarcolemmal potassium (ATP)-channels.

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Metadaten
Author: Katrin Birkenmeier
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000543-6
Title Additional (English):Physiological and functional characterization of cardiodepressive substances from the post-ischaemic, reperfused rat heart
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/12/01
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2008/11/21
Release Date:2008/12/01
Tag:Kalium(ATP)-Kanäle, isolierte Kardiomyozyten
isolated cardiomyocytes, potassium (ATP)-channel
GND Keyword:Herzmuskel, Ischämie, Myokardprotektion, Prostaglandine, Prostaglandinsynthase, Proteinkinase A, Reperfusion
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Innere Medizin
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie