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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001099-7

Entwicklung und Etablierung von Massenspektrometrie-basierten relativen und absoluten Quantifizierungsmethoden zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien

  • Massenspektrometrie hat sich zur Methode der Wahl für die globale relative und absolute Proteinquantifizierung entwickelt. Da das vorhandene Methodenspektrum in der Anzahl der zu analysierenden Proben limitiert ist und bei der Vermeidung von Vorfraktionierungstechniken keine globale Analyse erlaubt, war es das Ziel dieser Dissertation das Methodenspektrum anhand von anschaulichen Beispielen zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien zu erweitern. Dazu erstreckt sich diese Arbeit von der Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten der Isotopen markierten relativen Quantifizierungsmethode, über die Entwicklung eines globalen markierungsfreien relativen Quantifizierungsansatzes bis zur globalen absoluten Quantifizierung und weiter im speziellen der Stöchiometrie-Aufklärung eines Proteinkomplexes. Die Kombination aus 14N/15N metabolischer Markierung mit der GeLC-MS Technik erlaubt eine robuste relative Quantifizierung auf globaler Ebene. Durch die Verwendung eines internen 15N-markierten Referenzextraktes wurde eine bisher nicht erreichte zeitliche Auflösung von zehn Zeitpunkten bei der Untersuchung eines Nährstoffwechsels zwischen den bevorzugten Kohlenstoffquellen, Glukose und Malat, des Gram positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erreicht. Dieses Experiment zeigte klar, dass die Anpassung an Malat als zweite Kohlenstoffquelle sehr schnell passiert. Im Gegensatz dazu findet die Anpassung an Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle mit einer zeitlichen Verschiebung von ca. 45 Min. statt. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Anpassung an Malat hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene geschieht und die Anpassung an Glukose auf transkriptioneller Ebene stattfindet. Die geringe Reproduzierbarkeit von Vorfraktionierungstechniken beschränkt ihre Anwendung während einer markierungsfreien Quantifizierung. Die eingeschränkte Kombinationsmöglichkeit mit Vorfraktionierungstechniken führt zu einer geringeren Anzahl an identifizierten und quantifizierten Proteinen, was durch den Einsatz von Ausschlusslisten mit optimierten Messparametern in wiederholten Messungen mit einer eindimensionalen Chromatographie ausgeglichen wurde. Im Vergleich zu einer einfachen Wiederholung der Messung konnte die Anzahl an identifizierten Peptiden um 32 % gesteigert werden. Der Ausschlusslistenansatz konnte anschließend erfolgreich für eine markierungsfreie globale Proteinquantifizierung der Stickstoffmonoxid (NO) Stressantwort des humanpathogenen Stapylococcus aureus eingesetzt werden. Die Ergebnisse wurden mittels paralleler Quantifizierung mit 14N/15N metabolischen Markierung verifiziert. Mit dem Ansatz wurden fast 50 % des gesamten Proteoms identifiziert und 70 % davon konnten mit einem zu dem Markierungsexperiment vergleichbaren Ergebnis quantifiziert werden. Die Proteomsignatur der NO-Stressantwort zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu der von Antibiotika, die wie NO zu DNA-Strangbrüchen führen. Auch bei der absoluten Proteinquantifizierung kann nicht ohne Weiteres eine Vorfraktionierung eingesetzt werden. Durch die Verwendung einer „multiplexed LC-MS“ (LC-MSE) Methode wurde fast die Hälfte aller zytosolischen Proteine von B. subtilis mit einer hohen durchschnittlichen Sequenzabdeckung von 40 % identifiziert. Die Hi3-Methode ermögliche zusätzlich die absolute Quantifizierung fast aller identifizierten Proteine, die über fast vier Größenordnungen nachgewiesen werden konnten. Die Zuverlässigkeit des Ansatzes wurde für sechs Proteine mit der gut etablierten AQUA-Technik bestätigt. Mit der Hi3-Methode wurden zum einen absolute Proteomsignaturen für unterschiedliche Nährstoffsituationen erstellt, was auch Einblicke in die Regulation der Expression von Aminosäure-Biosynthese und –abbau-Enzyme ermöglichte. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Konzentration von ribosomalen und weiteren Wachstumsraten-abhängig benötigten Proteinen sich bei niedrigen Wachstumsraten nicht unterscheidet und erst ab einer Wachstumsrate von 0,8 Std.-1 linear ansteigt. Die vergleichsweise hohe Standardabweichung der Hi3-Methode (~30 %) erschwert ihre Anwendung bei der Bestimmung von nicht gradzahligen Protein-Komplex-Stöchiometrien. Deswegen wurde zur Analyse des RNA-Polymerase-Komplexes von B. subtilis der AQUA-Ansatz gewählt, der sich durch eine sehr geringe Standardabweichung auszeichnet (< 10 %). Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, welches auf einer mTRAQ-Markierung der Referenzpeptide und des verdauten Komplexes beruhte. Es war so möglich die bekannte Stöchiometrie des Kernkomplexes RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 zu bestätigen und zusätzlich die zwei ω-Unterheiten und die σ-Faktoren σA und σB absolut zu bestimmen. Die Menge an σB im Komplex nahm nach Glukose-Hunger und Ethanol-Stress auf bis zu 5 % zu und es konnte gezeigt werden, dass sich die Menge einer ω-Unterheit (YloH) sich im gleichen Maße im Komplex ändert, wie die Menge an σA.
  • Mass spectrometry has been developed as method of choice for comprehensive relative and absolute proteome analysis. Because the established quantification methods are limited in the number of samples for analysis and cannot be combined in each case with a pre fractionation, there is specific need for the development of new methods for mass spectrometry based proteome analysis. These methods should be established for Gram-positive bacteria as proof of principle. This thesis aimed at the expansion of the range of methods for demonstrative examples for physiological proteome analysis of Gram positive bacteria compiling the extension of label based relative protein quantification, the establishment of a global label free quantification approach, the development of a comprehensive absolute quantification method and furthermore the determination of the stoichiometry of a protein complex. The combination of 14N/15N metabolic labeling and GeLC-MS allows robust relative protein quantification on a global scale. The application of an internal 15N labeled reference extract enables never before achieved time resolved protein quantification (ten time points) within a nutritional shifts between the two preferred carbon sources (glucose and malate). Therefore Bacillus subtilis was selected as Gram positive model organism. In the result of this a very fast adaptation to malate as second carbon source has been observed, whereas the adaptation to glucose as second carbon is delayed by approx. 45 min. This finding revealed that the adaptation to malate is mainly post transcriptionally regulated and the adaptation to glucose in a transcriptional manner. The limited reproducibility of common proteomic pre fractionation techniques confines their application in combination with label free quantification methods leading to lower number of quantified proteins. To circumvent this drawback exclusion lists with iteratively improved instrument settings were introduced to LC-MS/MS analysis based on one dimensional chromatographic separation. This exclusion list based methods enabled to increase the number of identified peptides by 32 % compared to simple replicate measurements. By application of this workflow to nitric oxide stress (NO) response of human pathogen Staphylococcus aureus almost half of the entire proteome could be identified. Subsequent reliable label free quantification for 70 % of the identified proteins could be achieved. In comparison to the metabolic labeling approach combined with GeLC-MS a comparable result in terms of number of quantified proteins and fold changes was obtained. The quantitative evaluation of S. aureus stressed by NO adaptations illustrated the bacterial adaptation to the stress by higher expression of detoxifying enzyme, NO insensitive lactate dehydrogenase, DNA repair enzymes, biotin biosynthesis enzymes and phage L54a related proteins. Therefore this proteomic signature was similar to resistance mechanisms to antibiotics, also causing DNA strand breaks. The capabilities of pre fractionation techniques are limited for absolute quantification approaches as well. By application of the multiplexed LC-MS (LC-MSE) technique almost half of the predicted proteome of B subtilis with high average sequence coverage of 40 % could be identified. Absolute quantification for nearly all identified proteins over four orders of magnitude was achieved by application of the Hi3 approach. Comparative analysis with AQUA approach proved the high reliability of the global quantification results. The Hi3 approach enabled to set up absolute proteome signatures for different nutrient situation of B. subtilis and revealed new insights in the regulation of the expression of the amino acids biosynthesis and – degradation enzymes. Additionally the results showed that the intracellular proteins concentrations of ribosomal and other probably growth rate dependent regulated protein groups stay constant at low growth rates and are increasing linearly at a growth rate higher than 0.8 h-1. After development of reliable techniques for the purification of protein complexes the determination of the stoichiometric composition of multi-protein complexes becomes more and more important. The comparably high standard deviation of the Hi3 method confines the application of this approach for the exact determination of protein complex. Therefore the stoichiometry of RNA polymerase complex of B. subtilis was elucidated under different growth conditions by AQUA approach based on mTRAQ labeled synthetic peptides. The known stoichiometry of the core enzyme RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 could be shown. Under chosen growth conditions a stoichiometry of 1:1 relative to the core enzyme for the ω-subunit YkzG was determined. The concentration of the other ω subunit YloH was under all experimental conditions in the same range of σA (20 – 35 %). After ethanol stress and glucose starvation σB was found to be bound up to 5 % to the polymerase.

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Metadaten
Author: Jan Muntel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001099-7
Title Additional (English):Development and establishment of mass spectrometry based relative and absolute quantification methods for physiological proteome analysis of Gram positive bacteria
Advisor:Prof. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/11/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/11/03
Release Date:2011/11/07
Tag:Massenspektromie, Proteomik, Quantifizierung
Proteomics, Quantification, mass spectrometry
GND Keyword:Bakterien, Proteomanalyse, Quantifizierung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie