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Debarati Shome

• Reactive species play an essential role in orchestrating wound healing responses. They act as secondary messengers and drive redox-signaling pathways that are involved in the hemostatic, inflammatory, proliferative and remodeling phases of wound healing. Cold plasma produces a profusion of short- and long-lived redox species that promotes wound healing, however, until today, the knowledge of CAP mediated wound healing remained scarce. In this thesis, CAP mediated wound healing mechanism and their effect on extracellular matrix and adhesion molecules have been investigated. To this end, a keratinocyte cell line (HaCaT), skin fibroblast cell line (GM Fbs) and an in vitro coculture model including both HaCaT and GM Fbs at a 2:1 ratio, were employed to investigate the cross talk between these two skin cell types. We examined the impact of CAP on extracellular matrix proteins and cell adhesion molecules in GM Fbs and observed a significant impact of cold plasma treatment on the expression level of collagen moieties, cell adhesion molecule like integrin, cadherin, versican, MMPs as well as extracellular matrix proteins. Moreover, scratch assays with monocultures of HaCaT, GM Fbs and coculture of these two cell types were performed. We detected that, CAP accelerated the migratory capability of HaCaT cells cocultured with fibroblasts. In fact, compared to HaCaT monoculture, a significant acceleration on cell migration was observed in coculture upon CAP treatment. NAC, a potent antioxidant could abrogate this CAP-stimulated cell migration in coculture, further pointing towards the importance of well-orchestrated reactive species in wound healing. To better understand this CAP-mediated effect on cell migration, we examined the signaling pathways involved in tissue homeostasis and regeneration. We checked the HIPPO signaling pathway and observed an upregulation of several signaling molecules at transcriptional level in GM Fbs upon CAP treatment. YAP is the central nuclear executer of HIPPO signaling pathway. YAP was upregulated in both HaCaT cells and GM Fbs. The major downstream effectors of the HIPPO signaling pathway (CTGF and Cyr61) were also upregulated in dermal fibroblasts at both transcriptional and protein level. However, administration of antioxidant NAC inhibited CAP-mediated wound healing and abrogated the gene expression of the HIPPO downstream effectors. These results confirm that the upregulation of YAP-CTGF-CYR61 axis is due to CAP-generated redox species. In HaCaT cells, both CTGF and Cyr61 was minimally transcribed. Even though CTGF was rarely detected in HaCaT cells on the protein level,Cyr61 remained undetected. This again shows the importance of the cross talk between fibroblasts and keratinocytes. The coculture with the inclusion of fibroblasts showed an accelerated migration rate, compared to HaCaT monoculture which specifies a cross talk between these two cell types. Thus, monoculture of HaCaT cells were incubated with CAP-treated and untreated fibroblast conditioned medium. Interestingly, we observed that HaCaT cells exhibited an improved cell migration rate when incubated with CAP-treated fibroblast-conditioned media compared to that observed after incubation with untreated media. Upon investigation, an induction of CTGF and Cyr61 secretion was observed upon CAP treatment in the fibroblast-conditioned media. Furthermore, exposure to recombinant CTGF and Cyr61 could also significantly improve HaCaT cell migration which confirms that CAP mediated accelerated cell migration is due to activation of YAP-CTGF-Cyr61 axis. In conclusion, this study revealed a completely new mechanical insight of CAP mediated wound healing. Along with several other ECM molecules, CAP activates a regenerative signaling pathway i.e., HIPPO signaling pathway in dermal fibroblasts at the onset of wound healing. Dermal fibroblasts drive a paracrine interaction by secreting CTGF and Cyr61 in close vicinity of wound, resulting in accelerated keratinocyte migration and wound healing in coculture.
• Reaktive Spezies spielen eine wesentliche Rolle bei der Orchestrierung von Wundheilungsreaktionen. Sie wirken als sekundäre Botenstoffe und steuern Redox-Signalwege, die an den hämostatischen, entzündlichen, proliferativen und transformativen Phasen der Wundheilung beteiligt sind. Kaltes Plasma erzeugt eine Fülle von kurz- und langlebigen Redoxspezies, die die Wundheilung fördern. Das Wissen über die CAP-vermittelte Wundheilung ist jedoch noch rar. In dieser Arbeit untersuchten wir den CAP-vermittelten Wundheilungsmechanismus und seine Wirkung auf extrazelluläre Matrix- und Adhäsionsmoleküle. Zu diesem Zweck haben wir die Keratinozyten-Zelllinie (HaCaT), die Hautfibroblasten-Zelllinie (GM00637 Fbs) und ein In-vitro-Kokulturmodell ausgewählt, das sowohl HaCaT als auch GM Fbs im Verhältnis 2:1 um den cross-talk zwischen den beiden Zelltypen zu untersuchen. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde der Einfluss von CAP auf extrazelluläre Matrixproteine und Zelladhäsionsmoleküle in GM Fbs untersucht. Dabei konnten unterschiedliche Genexpressionsniveaus mehrerer Kollagene, Zelladhäsionsmoleküle wie Integrin, Cadherin, Versican, sowie MMPs und extrazelluläre Matrixproteine nach der Behandlung mit kaltem Plasma beobachtet werden. Darüber hinaus wurden Scratch-Assays mit Monokulturen von HaCaT, GM Fbs und Kokultur dieser beiden Zelltypen durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass CAP die Migrationsfähigkeit von mit Fibroblasten kokultivierten HaCaT-Zellen beschleunigt. Tatsächlich wurde im Vergleich zur HaCaT-Monokultur eine signifikante Beschleunigung der Zellmigration in der Kokultur nach CAP-Behandlung beobachtet. NAC, ein starkes Antioxidans, könnte diese CAP-stimulierte Zellmigration in der Kokultur aufheben, was die Bedeutung einer gut ausbalancierten Steuerung der reaktiven Spezies für die Wundheilung weiter unterstreicht. Um diesen CAP-vermittelten Effekt auf die Zellmigration zu verstehen, wurden die Signalwege, die an der Homöostase und Regeneration des Gewebes beteiligt sind, insbesondere der HIPPO-Signalweg, untersucht. Dabei wurde eine Hochregulation auf Transkriptionsebene von Signalmolekülen in GM Fbs nach CAP-Behandlung beobachtet. YAP ist der zentrale nukleare Vermittler des HIPPO-Signalwegs. YAP wurde sowohl in HaCaT Zellen als auch in GM Fbs hochreguliert. Die wichtigsten nachgeschalteten Effektoren des HIPPO-Signalwegs (CTGF und Cyr61) waren in dermalen Fibroblasten sowohl auf Transkriptions- als auch auf Proteinebene hochreguliert. Die Verabreichung des Antioxidans NAC konnte jedoch die CAP-vermittelte Wundheilung hemmen und die Genexpression der nachgeschalteten HIPPO-Effektoren aufheben. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Hochregulation der YAP-CTGF-CYR61-Achse auf CAP-erzeugte Redoxspezies zurückzuführen ist. In HaCaT-Zellen allein wurden sowohl CTGF als auch Cyr61 minimal transkribiert. Obwohl CTGF in HaCaT-Zellen (Proteinspiegel) nur minimal nachgewiesen wurde, blieb Cyr61 unentdeckt. Dies zeigt erneut die Bedeutung des parakrinen cross talks zwischen Fibroblasten und Keratinozyten. Die Kokultur unter Einbeziehung von Fibroblasten zeigte eine beschleunigte Migrationsrate im Vergleich zur HaCaT-Monokultur, was einen cross talk zwischen diesen beiden Zelltypen nahelegt. Daher wurde die Monokultur von HaCaT Zellen mit CAP-behandeltem und unbehandeltem Fibroblasten-konditioniertem Medium inkubiert. Interessanterweise beobachteten wir eine im Vergleich mit der nach Inkubation mit unbehandelten Medien deutlich verbesserte Zellmigrationsrate der HaCaT-Zellen bei Inkubation mit CAP-behandelten Fibroblasten-konditionierten Medien. Bei der Untersuchung wurde bei CAP-Behandlung in den Fibroblasten-konditionierten Medien eine Induktion der CTGF- und Cyr61-Sekretion beobachtet. Darüber hinaus könnte die Exposition gegenüber rekombinantem CTGF und Cyr61 auch die HaCaT-Zellmigration signifikant verbessern, was bestätigt, dass die CAP-vermittelte beschleunigte Zellmigration auf die Aktivierung der YAP-CTGF-Cyr61-Achse zurückzuführen ist. Zusammenfassend ergab diese Studie einen völlig neuen mechanistischen Einblick in die CAP-vermittelte Wundheilung. Zusammen mit der Regulation mehrerer ECM-Moleküle, aktiviert CAP einen regenerativen Signalweg, nämlich den HIPPO-Signalweg in dermalen Fibroblasten zu Beginn der Wundheilung. Dermale Fibroblasten steuern eine parakrine Wechselwirkung, indem sie CTGF und Cyr61 in unmittelbarer Nähe der Wunde sekretieren, was zu einer beschleunigten Keratinozytenmigration und Wundheilung in der Kokultur führt.