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Metaproteomics of marine thiotrophic symbioses – analysis of host-microbe interactions and symbiont physiologies with optimized methods

  • Symbiotic interactions are a key element of biological systems. One powerful strategy to gain insight into these interactions, and into biological systems in general, is the analysis of proteins expressed in situ using metaproteomics. In this thesis, host-microbe interactions in two mutualistic associations between chemosynthetic sulfur-oxidizing endosymbionts and marine invertebrates, the deep-sea tubeworm Riftia pachyptila and the shallow-water clam Codakia orbicularis, were studied by adapted and optimized metaproteomics methods. The Riftia symbiosis, which inhabits hydrothermal vents in the deep sea, and in which the host completely depends on its symbiont for nutrition, has fascinated researchers for about four decades. Yet, the interaction mechanisms between both partners have been understudied so far. Additionally, while different aspects of the host’s biology have been described, a comprehensive analysis has been lacking. Moreover, although only one symbiont 16S rRNA phylotype is present in Riftia, the symbiont population of the same host expresses proteins of various redundant or opposed metabolic pathways at the same time. As the symbionts also exhibit a wide variety in size and shape, symbionts of different size might have dissimilar physiological functions, which remained as of now to be elucidated. In this thesis, we addressed both, the host-symbiont interaction mechanisms, and physiological roles of symbiont subpopulations. A comprehensive Riftia host and symbiont protein database was generated as prerequisite for metaproteomics studies by de novo sequencing the host’s transcriptome and combining it with existing symbiont protein databases. This database was then used for metaproteomics comparisons of symbiont-containing and symbiont-free Riftia tissues, to gain insights into host-symbiont interactions on the protein level. The impact of energy availability on host-symbiont interactions was studied by comparing specimens with stored sulfur (i.e., high energy availability) with specimens in which sulfur storages were depleted. We employed optimized liquid chromatography peptide separation to increase metaproteome coverage. With this analysis, we identified proteins and mechanisms likely involved in maintaining the symbiosis, under varying environmental conditions. We unraveled key interaction mechanisms, i.e.: (i) the host likely digests its symbionts using abundant digestive enzymes, and, at the same time, (ii) a considerable part of the worm’s proteome is involved in creating stable internal conditions, thus maintaining the symbiont population. Furthermore, (iii) the symbionts probably employ eukaryote-like proteins to communicate with the host. (iv) Under conditions of restricted energy availability, the host apparently increases digestion pressure on the symbiotic population to sustain itself. Riftia symbionts of different size apparently have dissimilar metabolic roles, as revealed in this thesis. We enriched symbionts of different sizes using gradient centrifugation. These enrichments were subjected to protein extraction using a protocol optimized for the small sample amount available. Metaproteomics analysis included a gel-based workflow and evaluation of the complex dataset with machine learning techniques. Based on our metaproteomics study, we propose that Riftia symbionts of different cell size correspond to dissimilar physiological differentiation stages. Smaller cells are apparently engaged in cell differentiation and host interactions. Larger cells, on the other hand, seem to be more involved in synthesis of various organic compounds. Supposedly, in large symbionts endoreduplication cycles lead to polyploidy. Our results indicate that the Riftia symbiont employs a large part of its metabolic repertoire at the same time in the stable host environment. The symbiont of the shallow-water clam Codakia orbicularis, which, like the Riftia symbiont, relies on reduced sulfur compounds as energy source and fixes inorganic carbon, is, unexpectedly, also able to fix atmospheric nitrogen, as shown by metaproteomic, genomic and biochemical analysis. Potentially, this benefits the host, as Codakia digests its symbiont and might thus supplement its diet with organic nitrogen fixed by the symbionts in addition to organic carbon in its nitrogen-poor seagrass habitat.
  • Symbiotische Interaktionen sind ein Schlüsselelement biologischer Systeme. Eine leistungsfähige Möglichkeit, Erkenntnisse über diese Interaktionen und auch über biologische Systeme im Allgemeinen zu gewinnen, ist die Analyse von in situ exprimierten Proteinen mittels Metaproteomics. In dieser Arbeit wurden mittels adaptierter und optimierter Metaproteomics-Methoden Wirt-Mikroorganismen-Interaktionen in zwei mutualistischen Assoziationen zwischen chemosynthetischen schwefeloxidierenden Endosymbionten und marinen Invertebraten untersucht, dem Tiefsee-Röhrenwurm Riftia pachyptila und der Flaschwassermuschel Codakia orbicularis. Die Riftia-Symbiose, die Tiefsee-Hydrothermalquellen bewohnt, und in welcher der Wirt komplett abhängig von seinem Symbionten als einziger Nahrungsquelle ist, fasziniert Forscher seit über vier Jahrzehnten. Dennoch wurden Interaktionsmechanismen zwischen beiden Partnern der Symbiose bislang nur wenig untersucht. Zudem wurden einzelne Aspekte der Wirtsbiologie beschrieben, eine umfassende Analyse gab es bislang jedoch nicht. Darüber hinaus besteht die Riftia-Symbiontenpopulation zwar nur aus einem einzelnen 16S rRNA-Phylotypen, aber die Symbionten eines Wirtstieres exprimieren Proteins verschiedener redundanter oder gegenläufiger Stoffwechselwege zur selben Zeit. Da die Symbionten zudem in Größe und Form variieren, ist es möglich, dass Symbionten unterschiedlicher Größe verschiedene physiologische Funktionen haben. Dies wurde bislang nicht untersucht. In dieser Arbeit wurden sowohl Mechanismen der Wirt-Symbionten-Interaktion untersucht, als auch physiologische Rollen unterschiedlicher Symbionten-Subpopulationen. Als Grundlage für Metaproteom-Studien wurde eine kombinierte Wirts- und Symbionten-Proteindatenbank von Riftia erstellt. Dafür wurde das Wirtstranskriptom de novo sequenziert und mit existierenden Symbionten-Proteindatenbanken kombiniert. Die resultierende Datenbank wurde genutzt, um die Metaproteome von symbionten-haltigen Riftia-Wirtsgeweben mit symbiontenfreien Wirtsgeweben zu vergleichen, um Erkenntnisse über Wirt-Symbionten-Interaktionen auf Proteinebene zu gewinnen. Der Einfluss von Energieverfügbarkeit auf diese Interaktionen wurde untersucht, indem Tiere mit gespeichertem Schwefel (entsprechend hoher Energieverfügbarkeit) mit solchen verglichen wurden, in denen die Schwefelspeicher geleert waren. Um die Metaproteom-Abdeckung zu erhöhen, wurde eine optimierte Peptidseparation mittels Flüssigchromatographie genutzt. Auf diese Weise wurden Proteine und Mechanismen identifiziert, die wahrscheinlich am Erhalt der Symbiose unter unterschiedlichen Umweltbedingungen beteiligt sind. Es wurden Schlüsselmechanismen der Wirt-Symbionten-Interaktion identifiziert: (i) Der Wirt verdaut wahrscheinlich seine Symbionten mittels abundanter Verdauungsenzyme, und gleichzeitig (ii) ist anscheinend ein großer Teil der vom Wirt exprimierten Proteine daran beteiligt, stabile interne Bedingungen zu schaffen und damit die Symbiontenpopulation zu erhalten. (iii) Die Symbionten nutzen mutmaßlich eukaryoten-artige Proteine zur Kommunikation mit dem Wirt. (iv) Bei reduzierter Energieverfügbarkeit erhöht der Wirt vermutlich die Verdauung von Symbionten, um sich selbst zu erhalten. Weiters wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Riftia-Symbionten unterschiedlicher Größe sich wahrscheinlich in ihren physiologischen Funktionen unterscheiden. Um die Physiologie von Symbionten unterschiedlicher Größe zu untersuchen, wurden diese mittels Gradientenzentrifugation angereichert. Aus den Anreicherungen wurden Proteine unter Nutzung eines für geringe Probenmengen optimierten Protokolls extrahiert. Die Metaproteom-Analyse wurde mittels eines gelbasierten Verfahrens durchgeführt. Der resultierende komplexe Datensatz wurde mit Techniken des maschinellen Lernens ausgewertet. Nach den Ergebnissen dieser Metaproteom-Studie handelt es sich bei Symbionten unterschiedlicher Größe wahrscheinlich um physiologisch verschiedene Zelldiffenzierungs-Stadien. Kleinere Zellen teilen sich vermutlich aktiv und etablieren Interaktionen mit dem Wirt. Größere Zellen hingegen sind anscheinend primär aktiv in der Synthese verschiedener organischer Verbindungen. In größeren Symbionten scheint zudem Endoreduplikation stattzufinden, die zu Polyploidie führt. Den Ergebnissen dieser Studie zufolge nutzt der Riftia-Symbiont wahrscheinlich simultan einen Großteil seines metabolischen Potentials in der stabilen Wirtsumgebung. Der Symbiont der Flachwasser-Muschel Codakia orbicularis nutzt wie der Riftia-Symbiont reduzierte Schwefelverbindungen als Energiequelle und fixiert anorganischen Kohlenstoff. Darüber hinaus ist der Codakia-Symbiont unerwarteterweise in der Lage, atmosphärischen Stickstoff zu fixieren. Dies wurde mittels metaproteomischer, genomischer und biochemischer Analysen gezeigt. Die Stickstoff-Fixierung durch den Symbionten könnte ein Vorteil für den Wirt der in einer stickstoffarmen Umgebung lebenden Codakia-Symbiose sein, da der C. orbicularis-Wirt seine Symbionten verdaut und somit zusätzlich zu organischem Kohlenstoff auch von den Symbionten fixierten organischen Stickstoff erhalten könnte.

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Metadaten
Author: Tjorven HinzkeORCiD
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-39738
Title Additional (German):Metaproteomische Untersuchung mariner thiotropher Symbiosen – Analyse von Wirt-Symbionten-Interaktionen und Symbionten-Physiologien mit optimierten Methoden
Referee:Prof. Dr. Thomas Schweder, Prof. Dr. Silvia Bulgheresi, Prof. Dr. François Lallier
Advisor:Prof. Dr. Thomas Schweder, Dr. Stephanie Markert
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/10/12
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/09/14
Release Date:2020/10/12
Tag:Codakia orbicularis; Riftia pachyptila; chemosynthesis; deep sea; holobiont; host-microbe interactions; hydrothermal vent; metaproteomics
GND Keyword:Symbiose, Proteomics, Hydrothermalquelle, Molekularbiologie
Page Number:184
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie