Open Access

Lisa Wolff

• Pentathiepins are cyclic polysulfides that exert antiproliferative and cytotoxic activity in cancer cells, induce oxidative stress and apoptosis, and potently inhibit GPx1. These properties render this class of compounds promising candidates for the development of anticancer drugs. However, the biological effects and how they intertwine to promote high cytotoxicity have not been systematically assessed throughout a panel of cancer cell lines from distinct tissues of origin. In this thesis, six novel pentathiepins were analyzed and constitute the second generation of compounds with additional properties such as fluorescence or improved water solubility to facilitate cellular testing. All compounds underwent extensive biological evaluation in 14 human cancer cell lines. These studies included investigations of the inhibitory potential with regards to GPx1 and cell proliferation, examined the cytotoxicity in human cancer cell lines, as well as the induction of oxidative stress and DNA strand breaks. Furthermore, selected hallmarks of apoptosis, ferroptosis, and autophagy were studied. Experimental approaches regarding these cellular mechanisms included observing morphological changes, detecting phosphatidyl serine exposure and caspase activity, and quantifying cleaved PARP1 and levels of LC3B II. In addition, the analysis of the cell cycle aimed to identify aberrations or arrests in cell division. Five of the six tested pentathiepins proved to be potent inhibitors of the GPx1, while all six exerted high cytotoxic and antiproliferative activity, although to different extents. There was a clear connection observed between the potential to provoke oxidative stress and damage to DNA in the form of single- and double-strand breaks both extra- and intracellularly. Furthermore, various experiments supported apoptosis but not ferroptosis as the mechanism of cell death in four different cell lines. In particular, the externalization of PS, the detection of activated caspases, and the cleavage of PARP1 corroborated this conclusion. Additionally, indications for autophagy were found, but more investigations are required to verify the current data. The findings of this dissertation are mainly in line with the postulated mechanism of action proposed for pentathiepins and a previous publication from our group that described their biological activity. However, the influence of modulators such as oxygen and GSH on the biological effects was ambiguous and dependent on the compound. The expression profile of the cell lines concerning GPx1 and CAT did not influence the cellular response toward the treatment, whereas the cell doubling time correlated with the cytotoxicity. As the various pentathiepins give rise to different biological responses, modulation of the biological effects depends on the distinct chemical structures fused to the sulfur ring. This may allow for future optimization of the anticancer activity of pentathiepins. An analysis of the structure-activity relationships revealed that the piperazine scaffold was associated with superior biological activity compared to the pyrrolo-pyrazine backbone. Furthermore, substituents with electron-withdrawing properties or those providing a free electron pair, such as fluorine or morpholine, were advantageous. These findings should help design and synthesize the next generation of pentathiepins, thereby expanding the library of compounds, allowing for the further deduction of structure-activity relationships and an improved understanding of their mechanism of action.
• Pentathiepine sind zyklische Polysulfide, die in Krebszellen eine antiproliferative und zytotoxische Wirkung entfalten, oxidativen Stress und Apoptose auslösen und potente Inhibitoren der Glutathionperoxidase 1 (GPx1) sind. Diese Eigenschaften machen diese Klasse von Verbindungen zu vielversprechenden Kandidaten für die Entwicklung von Krebsmedikamenten. Die biologischen Wirkungen und ihr Zusammenspiel, mit dem eine hohe Zytotoxizität einhergeht, wurden jedoch noch nicht systematisch in einer Reihe von Krebszelllinien aus verschiedenen Ursprungsgeweben untersucht. In dieser Arbeit wurden sechs neuartige Pentathiepine analysiert, die eine zweite Generation von Verbindungen darstellen: mit zusätzlichen Eigenschaften wie Fluoreszenz oder verbesserter Wasserlöslichkeit um zelluläre Tests zu erleichtern. Alle Verbindungen wurden einer umfassenden biologischen Bewertung in 14 menschlichen Krebszelllinien unterzogen. Diese Studien umfassten Untersuchungen des hemmenden Potenzials in Bezug auf GPx1 und die Zellproliferation, untersuchten die Zytotoxizität in menschlichen Krebszelllinien sowie die Induktion von oxidativem Stress und DNA-Strangbrüchen. Darüber hinaus wurden ausgewählte Merkmale der Apoptose, Ferroptose und Autophagie untersucht. Zu den experimentellen Ansätzen in Bezug auf diese zellulären Mechanismen gehörten die Beobachtung morphologischer Veränderungen, der Nachweis der Phosphatidylserin (PS)-Externalisierung und der Caspase-Aktivität sowie die Quantifizierung von gespaltenem PARP1 und der LC3B II-Konzentration. Die Analyse des Zellzyklus zielte außerdem darauf ab, Abweichungen oder Unterbrechungen bei der Zellteilung zu ermitteln. Fünf der sechs getesteten Pentathiepine erwiesen sich als potente Inhibitoren der GPx1, während alle sechs eine hohe zytotoxische und antiproliferative Aktivität ausübten, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß. Es wurde ein klarer Zusammenhang zwischen dem Potenzial, oxidativen Stress zu verursachen, und DNA-Schäden in Form von Einzel- und Doppelstrangbrüchen sowohl extra- als auch intrazellulär hervorzurufen, beobachtet. Darüber hinaus unterstützten verschiedene Experimente in vier verschiedenen Zelllinien die Annahme, dass Apoptose und nicht Ferroptose als Zelltodmechanismus vorliegt. Insbesondere die Externalisierung von PS, der Nachweis von aktivierten Caspasen und die Spaltung von PARP1 untermauerten diese Schlussfolgerung. Darüber hinaus wurden Hinweise für die Auslösung von Autophagie gefunden; es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die aktuellen Daten zu verifizieren. Die Ergebnisse dieser Dissertation stehen im Wesentlichen im Einklang mit dem postulierten Wirkmechanismus der Pentathiepine und einer früheren Veröffentlichung unserer Gruppe, in der ihre biologische Aktivität beschrieben wurde. Der Einfluss von Modulatoren wie Sauerstoff und GSH auf die biologischen Wirkungen war jedoch nicht eindeutig und von der jeweiligen Verbindung abhängig. Das Expressionsprofil der Zelllinien hinsichtlich GPx1 und Catalase hatte keinen Einfluss auf die zelluläre Reaktion auf die Behandlung, während die Zellteilungszeit mit der Zytotoxizität korrelierte. Da die verschiedenen Pentathiepine unterschiedliche biologische Reaktionen hervorrufen, hängt die Modulation der biologischen Wirkungen von den unterschiedlichen chemischen Strukturen ab, die an den Schwefelring gebunden sind. Dies könnte in Zukunft eine Optimierung der krebsbekämpfenden Wirkung von Pentathiepinen ermöglichen. Eine Analyse der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ergab, dass das Piperazingerüst im Vergleich zum Pyrrolo-Pyrazin-Grundgerüst mit einer höheren biologischen Aktivität verbunden war. Außerdem waren Substituenten mit elektronenziehenden Eigenschaften oder solche, die ein freies Elektronenpaar bereitstellen, wie Fluor oder Morpholin, von Vorteil. Diese Erkenntnisse sollten dazu beitragen, die nächste Generation von Pentathiepinen zu entwerfen und zu synthetisieren und damit die Bibliothek der Verbindungen zu erweitern, was die weitere Ableitung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen und ein besseres Verständnis ihres Wirkmechanismus ermöglicht.