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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-26311

Herstellung sicherer und wirksamer Lebendvakzine gegen die Koi Herpesvirus Infektion von Karpfen

  • Das Koi Herpesvirus (KHV, Cyprinid herpesvirus 3) verursacht eine tödliche Erkrankung bei Kois und Karpfen. Um sichere und wirksame Lebendvirusimpfstoffe zu erhalten, haben wir Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von KHV erzeugt, aus deren Genom die für die beiden Nukleotidstoffwechselenzyme Thymidinkinase (TK, ORF55) und Desoxyuridin-Triphosphatase (DUT, ORF123) codierenden Leserahmen gezielt entfernt worden waren. Die Mutationen wurden durch homologe Rekombination in den zellkulturadaptierten aber noch virulenten Stamm KHV-T eingeführt. Umfangreiche in vitro Tests zeigten, dass die Deletion der TK- und DUT- Gene die KHV-Replikation in Zellkultur (CCB Zellen) nicht erkennbar beeinträchtigt. In vivo Tests an Jungkarpfen zeigten jedoch eine im Vergleich zum Ausgangsvirus signifikant reduzierte Virulenz der Einzelgen-Deletionsmutanten eine fast vollständige Attenuierung der Doppelmutante. Dennoch waren alle immunisierten Karpfen gegen eine letale Belastungsinfektion mit virulentem KHV geschützt. Mittels einer neu entwickelten Triplex-Real-Time-PCR und aus Kiementupferproben isolierter DNA war es möglich, mit TK-negativem KHV immunisierte und Wildtyp- infizierte Karpfen zu differenzieren. Daher könnte die Doppelmutante KHV- TΔDUT/TK als genetischer Marker-Impfstoff geeignet sein. In einer zweiten Studie wurde die Funktion von vier immunogenen Hüllglykoproteinen der ORF25-Genfamilie (ORF25, ORF65, ORF148 und ORF149) von KHV untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass alle vier Gene für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Während die Deletion von ORF65 keinen erkennbaren Einfluss auf die Virusvermehrung hatte, führte die Deletion von ORF148 sogar zu einer leicht erhöhten Replikationsrate. Im Gegensatz dazu bewirkten Deletionen von ORF25 oder ORF149 einen verzögerten Eintritt in die Wirtszellen und damit auch eine verlangsamte Vermehrung und Ausbreitung der Viren. Interessanterweise führte die gemeinsame Deletion der Gene ORF148 und ORF149 zu einem wildtypähnlichen Wachstumsverhalten, das auf gegensätzlicher Funktionen der beiden Proteine hindeutete. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von CCB-Zellen, die mit den verschiedenen Glykoproteindeletionsmutanten infiziert waren, zeigten keine Auswirkungen auf die Bildung und Reifung der Virionen im Zellkern oder im Zytoplasma, oder die Virusfreisetzung. Im Tierversuch erwiesen sich KHV-Mutanten mit Deletionen der Gene ORF148 und/oder ORF149 als geringfügig, aber für eine Verwendung als Lebendvirus-Impfstoff nicht ausreichend abgeschwächt. Überlebende Fische waren jedoch gegen Belastungsinfektionen ebenso gut geschützt wie Wildtyp-infizierte Karpfen, so dass die Deletion dieser antikörperinduzierenden Proteine zur Entwicklung von KHV-Markerimpfstoffen beitragen könnte, die eine serologische Differenzierung von Wildtyp-infizierten und geimpften Fischen erlauben (DIVA- Prinzip). In einer dritten Studie wurden durch serielle Zellkulturpassage von virulentem KHV und anschließende in vivo Infektionsversuche Hinweise darauf gefunden, dass das bislang nicht näher charakterisierte, neben dem ORF149 Gen lokalisierte ORF150 für einen weiteren Virulenzfaktor von KHV codiert. Möglicherweise könnte also durch eine kombinierte Deletion der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten KHV-Gene ein sicherer und wirksamer, genetisch und serologisch differenzierbarer Markerimpfstoff hergestellt werden.
  • Koi herpesvirus (KHV, Cyprinid herpesvirus 3) causes a fatal disease of koi and common carp. To obtain safe and efficacious live virus vaccines, we generated single and double deletion mutants of KHV lacking the genes encoding the nucleotide metabolism enzymes thymidine kinase (TK, ORF55) and deoxyuridine triphosphatase (DUT, ORF123). The mutations were introduced by homologous recombination in the cell culture adapted, but still virulent strain KHV-T. In vitro tests showed that deletion of the TK and DUT genes does not affect KHV replication in CCB cell cultures. In vivo tests using juvenile carp revealed that virulence of the single deletion mutants was significantly reduced compared to parental wild type virus, and that the double mutant was almost completely attenuated. Nevertheless, all immunized carp were protected against lethal challenge infections with virulent KHV. Using a novel triplex-real-time PCR and isolated DNA from gill swab samples, carp immunized with TK-deleted KHV could be differentiated from wild-type infected fish. Therefore, the double mutant KHV-TΔDUT/TK might be suitable as a genetic marker vaccine. In a second study the functions of four immunogenic envelope glycoproteins, encoded by the ORF25 gene family (ORF25, ORF65, ORF148, and ORF149) of KHV. It was observed that the four genes are not essential for in vitro virus replication. Whereas deletion of ORF65 did not detectably affect replication, deletion of ORF148 even slightly enhanced virus growth. In contrast, deletions of ORF25 or ORF149 led to delayed entry into host cells, resulting in decelerated replication and spread of the virus. Interestingly, double deletion of the genes ORF148 and ORF149 restored wild-type-like growth properties, indicating opposite functions of the two proteins. Electron microscopy of CCB cells infected with the different glycoprotein gene deletion mutants showed no effect on the formation and maturation of the virions in the cell nucleus or in the cytoplasm, nor on virus release. In animal experiments the virus mutants lacking ORF148 and/or ORF149 proved to be slightly but insufficiently attenuated for use as a live virus vaccines. However, surviving carp were completely protected against lethal challenge infections, and, thus, deletion of these antibody- inducing proteins might contribute to development of vaccines which permit serological differentiation of immunized from wild-type infected animals (DIVA principle).In a third study serial cell culture passages of virulent KHV-T and subsequent animal experiments indicated that the uncharacterised ORF150, which is located upstream of ORF149, might encode another virulence factor of KHV. Thus, combined deletion of the KHV genes analysed in the different parts of this thesis might result in a safe and efficacious genetic, und serological DIVA vaccine.

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Metadaten
Author: Lars Schröder
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-26311
Title Additional (English):Development of a safe and efficient live virus vaccine against a koi herpesvirus infection in carp
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/05/14
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/04/12
Release Date:2019/05/14
Tag:DIVA Vakzine, KHV
GND Keyword:Vakzine
Pagenumber:121
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften