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Discovery and Characterization of Novel Carbohydrate-Active Enzymes from Marine Bacteria

  • Die Hälfte der globalen Primarproduktion wird in den Ozeanen realisiert und dabei wird ein großer Anteil des fixierten CO2 genutzt, um Algenpolysaccharide zu synthetisieren. Diese Kohlenhydrate dienen als wichtige Kohlenstoff- und Energiequelle für marine Nahrungsnetze, wobei sie von kohlenhydrataktiven Enzymen zu monomeren Zuckern umgesetzt werden. Da bisher wenig über den enzymatischen Abbau von Algenpolysacchariden in den Ozeanen bekannt ist, war es das Ziel dieser Arbeit, zu einem tieferen Verständnis dieser Prozesse beizutragen. O-Methylierungen stellen stabile Modifikationen an Zuckern in marinen und terrestrischen Polysacchariden dar. Es wurde in Artikel I gezeigt, dass Cytochrom P450 Monooxygenasen eine wichtige Funktion in enzymatischen Abbausystemen aus marinen Bakterien für Agar haben, wobei diese Enzyme die oxidative Demethylierung von 6-O-Methyl-D-galaktose, einem Monomer aus Rotalgenpolysacchariden, katalysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es sich bei der P450-Subfamilie CYP236A um die zweite beschriebene Gruppe von kohlenhydrataktiven Monooxygenasen handelt. Die charakterisierten P450s sind hochspezifisch für 6-O-Methyl-D-galaktose und akzeptieren keine typischen P450-Substrate. Um die molekularen Faktoren für den spezifischen Umsatz dieses polaren Substrates aufzuklären, wurde Proteinkristallografie genutzt (Artikel II). Die Kristallstruktur der P450 Monooxygenase aus Z. galactanivorans mit gebundenem Substratmolekül zeigt, dass sowohl Wasserstoffbrückenbindungen als auch hydrophobe Interaktionen an der Substraterkennung beteiligt sind, was zusätzlich durch ITC sowie Mutationsstudien bestätigt wurde. Schnellwachsende Grünalgen der Gattung Ulva führen weltweit zu gefährlichen Algenblüten. Ein Hauptbestandteil der gebildeten Biomasse stellt das anionische Polysaccharid Ulvan dar. Bisher war der enzymatische Ulvanabbau kaum verstanden, was die sinnvolle Nutzung von Ulva-Biomasse erschwerte. Die detaillierte biochemische Charakterisierung einer Ulvanlyase auf F. agariphila wird in Artikel III gezeigt. Dieses Enzym katalysiert den ersten Schritt im Ulvanabbau und die biochemischen Parameter stimmen mit den Umweltbedingungen in Küstenbereichen des gemäßigten Ozeans überein, dem Habitat, aus dem dieses Bakterium isoliert wurde. Alle nachfolgenden Schritte im kompletten enzymatischen Ulvanabbau wurden aufgeklärt und sind in Artikel IV zum ersten Mal beschrieben. Insgesamt 13 Enzyme aus den Klassen der Polysaccharidlyasen, Glykosidhydrolasen sowie Sulfatasen agieren in einer komplexen Kaskade zusammen, um schlussendlich monomere Zucker aus Ulvan bereitzustellen. Die gezeigten Identifizierungen und Charakterisierungen von neuen kohlenhydrataktiven Enzymen tragen nicht nur zu einem besseren Verständnis der Vorgänge im marinen Kohlenstoffkreislauf bei, sondern bilden zudem die Grundlage für zukünftige biotechnologische Prozesse. Eine effiziente enzymatische Depolymerisation der Algenpolysaccharide ist nötig, um Bioraffineriekonzepte basierend auf Algenkohlenhydraten zu realisieren. Dabei können über mikrobielle Fermentation Biokraftstoffe der zweiten Generation oder andere nützliche Produkte hergestellt werden.
  • Half of the global primary production is realized in the ocean and a large proportion of the fixed CO2 is used to produce algal polysaccharides. These carbohydrates are a main carbon and energy source fueling marine food webs where they are degraded into monomeric sugars by carbohydrate active enzymes. As the knowledge about the enzymatic degradation of algal polysaccharides in the ocean is still scarce, this thesis aimed to contribute to a deeper understanding of these processes. O-methylation of sugars is a common and very stable modification in marine and terrestrial polysaccharides. It was shown in Article I that cytochrome P450 monooxygenases are an integral part of agar depolymerization systems from marine bacteria where these enzymes catalyze the oxidative demethylation of 6-O-methyl-D-galactose, a monomer found in red algal polysaccharides. These findings place the P450 subfamily CYP236A into the group of carbohydrate-active enzymes as a second class of monooxygenases. The characterized P450s are highly specific for 6 O methyl D galactose and do not accept typical P450 substrates. To understand the molecular determinants for the specific conversion of the polar substrate, protein crystallography was used (Article II). The crystal structure of the P450 from Z. galactanivorans bound to a substrate molecule showed that hydrogen bonding and hydrophobic interactions are involved in substrate recognition, which was further supported by ITC experiments and mutational studies. Fast growing green algae from the genus Ulva cause dangerous algal blooms worldwide. A main constituent of the formed biomass is the anionic polysaccharide ulvan. Enzymatic ulvan degradation was only poorly understood, hampering the use of Ulva biomass in a productive way. The detailed biochemical characterization of an ulvan lyase from F. agariphila is shown in Article III. This enzyme catalyzes the initial step in ulvan degradation and the biochemical parameters match the conditions found in coastal regions of the temperate ocean, the area from which the bacterium was isolated. The subsequent enzymatic steps for the complete degradation of ulvan were elucidated and described in Article IV for the first time. 13 enzymes belonging to the classes of polysaccharide lyases, glycoside hydrolases and sulfatases act together in a complex cascade to eventually produce monosaccharides from ulvan. The presented discovery and characterization of novel carbohydrate-active enzymes do not only contribute to a better understanding of the processes involved in the marine carbon cycle but are also of significant importance for future biotechnological processes. An efficient enzymatic depolymerization of algal polysaccharides will be necessary for biorefinery concepts that are based on algal carbohydrates as starting material for microbial fermentation to produce second generation biofuels and other useful products.

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Metadaten
Author: Lukas ReiskyORCiD
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-27050
Title Additional (German):Identifizierung und Charakterisierung von Neuen Kohlenhydrataktiven Enzymen aus Marinen Bakterien
Referee:Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Prof. Dr. Magali Remaud-Simeon, Prof. PhD Emma Master
Advisor:Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/06/05
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/06/04
Release Date:2019/06/05
GND Keyword:Enzym
Pagenumber:233
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie