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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-37643

Charakterisierung der pestiviralen Glykoproteine E1 und E2

  • Das Bovine Virale Diarrhoe Virus (BVDV) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae. BVDV verursacht eine gefährliche Durchfallerkrankung bei Rindern, besonders Kälbern, die Bovine Virusdiarrhoe (Mucosal Disease). BVDV gehört zu den einzelsträngigen RNA-Viren und ist eng verwandt mit dem Erreger der Klassischen Schweinepest sowie der Border Disease der Schafe. Wie andere Pestiviren, ist BVDV ein behülltes Virus, auf dessen Hülle drei Strukturproteine (Erns, E1 und E2) zu finden sind. In dieser Arbeit wurden die Glykoproteine E1 und E2 genauer charakterisiert, um Hinweise auf den Mechanismus der Knospung (Budding) von Pestiviren zu erhalten. Dazu ist die subzelluläre Lokalisation, die Topologie sowie der Retentionsmechanismus für E1 und E2 genauer untersucht worden. Die subzelluläre Lokalisation der Hüllproteine wurde mit Hilfe von Kolokalisationsanalysen mit spezifischen Kompartimentmarkerproteinen bestimmt. Sowohl als Einzelexpression als auch nach Expression als E1-E2-Vorläuferprotein zeigte sich eine Anreicherung der beiden Proteine vorwiegend im ER. Die Lokalisationsanalyse E2s in mit verschiedenen BVDV-Stämmen infizierten Zellen zeigte ein sehr ähnliches Bild wie die Einzelexpression. Die, die intrazelluläre Retention vermittelnden, Regionen wurden zunächst mit CD72-Fusionsproteinen eingegrenzt und zeigten, dass die Transmembrandomänen der Proteine für die Retention entscheidend waren. Anhand verschiedenster Mutanten, welche Substitutionen, Insertionen und Deletionen im Bereich des C-Terminus von CD72-E1 bzw. E2 (ohne CD72-Fusionspartner) beinhalteten, konnten einzelne Aminosäuren identifiziert werden, die essentiell für die Retention sind oder diese zumindest beeinflussen. Für E2 konnte das Arginin an Position 355 als wichtig für die Retention bestätigt und weiterführend untersucht werden. Mit Mutationen des Glutamins an Position 370 konnte außerdem der modulierende Effekt des cytoplasmatischen Rests auf die Retention E2s gezeigt werden. Die Retention von E1 ist unabhängig von der Länge der TMD und wird durch mehrere polare Aminosäuren (K174, R177, Q182) beeinflusst. Die Topologieuntersuchungen für E1 und E2 nach Einzelexpression mit Tag-markierter Proteinvarienten zeigte, dass die reifen Proteine eine einspännige Transmembrandomäne mit dem N-Terminus auf der luminalen und dem C-Terminus auf der cytosolischen Seite des ERs besitzen.
  • The Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus within the family of Flaviviridae. BVDV causes a severe diarrhea in cattle, especially calves, called bovine viral diarrhoea (mucosal disease). BVDV belongs to the single-stranded RNA viruses and is closely related to the pathogen of classical swine fever and border disease in sheep. Like other pestiviruses, BVDV is an enveloped virus whose envelope contains three structural proteins (Erns, E1 and E2). In this work, the glycoproteins E1 and E2 were further characterized to get first information about the viral budding mechanism. For that reason the subcellular localization, the retention as well as the membrane topology of E1 and E2 were analyzed. The subcellular localization of E1 und E2 were elucidated by performing colocalization experiments with compartment marker proteins using immunofluorescence microscopy. The results showed a localization predominantly in the ER for single- and E1-E2-precurser expressed glycoproteins. Infection studies with different BVDV strains also showed a predominantly localization in the ER for E2. To characterize the requirements for intracellular retention CD72-chimeric and mutated proteins were used. In both proteins, the transmembrane domain was responsible for retention. In further experiments, different amino acids in the C-Terminus of E1 or E2 were substituted, deleted or inserted and the influence on the retention of the mutants was analyzed. Arginine (position 355 in E2) could be confirmed and further characterized as an important amino acid for the retention behavior. Moreover, with glutamine on position 370 (E2), the modulating effect of the cytoplasmic tail could be demonstrated. The retention of E1 was independent of TMD length, but influenced by several polar amino acids (K174, R177, and Q182). The topology experiments for single-expressed and tag-marked proteins revealed a single spanned transmembrane domain with the N-terminus on the luminal and the C-Terminus on the cytosolic side of the ER.

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Metadaten
Author: Christina Radtke
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-37643
Title Additional (English):Characterisation of pestiviral glycoproteins E1 and E2
Referee:PD Dr. Michael Knittler, Prof.Dr. Norbert Tautz
Advisor:Dr. Birke Andrea Tews
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/05/19
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/11/25
Release Date:2020/05/19
Tag:Glykoproteine, Lokalisation, Pestivirus, Retention, Topologie
GND Keyword:bvdv
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie