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Benetzungsmittel für das trockene Auge im Zellkulturtest an humanen konjunktivalen und kornealen Zelllinien unter Austrocknungsexposition

  • Das trockene Auge ist eine häufige multikausale Augenerkrankung, welche nicht selten mit einer erheblichen Einschränkung der Lebensqualität einhergeht. Therapie der Wahl ist die Anwendung von Tränensubstitutionspräparaten. Ziel dieser pharmakologischen und zytomorphologischen Untersuchung war die Evaluation der Wirkung und des protektiven Effekts von fünf kommerziellen, auf Hyaluronsäure basierenden Medikamenten und einem Testpräparat an humanen konjunktivalen (Chang) und kornealen (pRSV-T) Epithelzellen. Dafür wurden die Zellen jeder Zelllinie mit einer Zellzahl von 1,5x104 jeweils in einer 96-well-Platte bis zum konfluenten Wachstum inkubiert. Für den Zellversuch wurden die Zellen jeder Vertiefung für 20 Minuten jeweils mit 50μl der zu testenden Proben inkubiert. Als Positivkontrolle wurde das Medium in den Vertiefungen belassen und als Negativkontrolle diente die gleiche Menge an PBS. Die Zellen wurden einem standardisierten Stressfaktor (Luft) für eine der Austrocknungszeiten 0, 15, 30 oder 45 Minuten ausgesetzt. Anschließend erfolgte eine vierstündige Inkubation mit dem Farbstoff alamarBlueR. Aus den mit dem ELISA-Reader gemessenen Absorptionswerten wurde daraufhin die Überlebensrate fur jede Austrocknungszeit ermittelt. Bei dem LIVE/DEADR Viability/ Cytotoxicity Kit wirkte auf die Zellen nach Austrocknung bei Raumtemperatur für 20 Minuten eine Propidium-Jodit-Calcein-Losung ein. Für die Auswertung wurde die Relation von vitalen und avitalen Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop evaluiert. Probe 2 imponierte im zeitlichen Verlauf für beide Zelllinien mit einer sehr geringen Verlustrate vitaler Zellen. Verglichen dazu wies das Testpräparat einen starken Zellzahlabfall auf. Alle weiteren Proben zeigten insgesamt eine gute protektive Wirkung auf die Zellen. Es fiel auf, dass diese umso großer war, je hoher Hyaluronsäure im Präparat konzentriert war. Probe 2 mit 0,3% Hyaluronsäure zeigte die besten Überlebensraten. Über das Testpräparat lassen sich aufgrund fehlender Informationen über dessen pharmakologische Zusammensetzung nur beschrankt Aussagen machen. Sowohl die Chang- als auch die pRSV-T-Zellen zeigten allerdings unter dessen Wirkung nach 20 Minuten Einwirkzeit und nach 0 und 15 Minuten Austrocknung eine überdurchschnittlich hohe Verlustrate, sodass hier ein toxischer Effekt nicht unwahrscheinlich ist. Bei allen untersuchten Proben wurde mit zunehmender Expositionszeit ein Abfall vitaler Zellen verzeichnet. Schlussfolgernd lasst sich sagen, dass Zellkulturverfahren geeignete Methoden sind, um modellhaft den Effekt von ophthalmo-pharmakologischen Zubereitungen für die Augenoberflache zu evaluieren. Grundsätzlich ist eine höhere Konzentration von Hyaluronsäure in Benetzungsmitteln mit einem höheren Austrocknungsschutz und einer antiinflammatorischen Wirkung assoziiert. Auch die Wahl des Puffers spielt eine wichtige Rolle in Bezug auf die Protektion. Für ein optimales Benetzungsmittel kann additiv Natriumchlorid eingesetzt werden. Zellen in vitro reagieren auf verschiedene Expositionen meist wegen der nicht zu simulierenden Barrierefunktion der Augenoberflache deutlich empfindlicher als intaktes Oberflächenepithel, dennoch lassen sich für die klinische Praxis einige Tendenzen ableiten.
  • Background: Tear film instability and hyperosmolarity are causes of dry eye. The most effective lubricant for tear film stabilization targeting tear film instability is hyaluronic acid (HA). It is suggested to be protective for epithelium in dry eye. This study was performed in vitro with commercially available solutions containing HA in various concentrations. To evaluate the desiccation protection capability we employed a reproducible in vitro cell culture system. Material/Methods: Conjunctival (Chang 1-5c-4) and corneal cells (pRSV-T 2.040) were cultivated under standard conditions until confluent cell growth. The cells were wetted with five commercial ophthalmic solutions and one agent in trial phase (sample 1: 0.1% HA; sample 2: 0.3% HA; sample 3: 0.15% HA, 2% dexpanthenol; sample 4: 0.1% HA; sample 5: 0.2% HA; sample 6: unknown). After 20 minutes cells were exposed to continuous air flow for 0, 15, 30 and 45 minutes. Assessment of viable cells was performed by alamarBlue® assay and LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit. Results: Greatest protection was observed at 15 minutes. Best results in protection from desiccation was assessed with sample 2. It showed an average survival rate of 91% even at 45 minutes exposure time, whereas no significant amount of vital cells were detected after application with sample 6. It was the only substance that presented with early significant cell loss at 0 and 15 minutes by 35%. Conclusions: High concentration of HA (0.3%) and an ionic composition close to the normal tearfluid seem to provide the best protective effect against desiccation in experimental dry eye.

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Metadaten
Author: Fatma Ahmed
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-38174
Title Additional (German):Evaluation of protection against desiccation with different artificial tears containing 0.1%-0.3% hyaluronic acid in experimental dry eye model
Referee:Prof. Dr. med. Frank Tost, Prof. Dr. med Frank Schüttauf
Advisor:Prof. Dr. med Frank Tost
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/06/19
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2020/05/18
Release Date:2020/06/19
GND Keyword:Hyaluronsäure
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit