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Aufklärung neuer Komponenten des regulatorischen Netzwerks von Bacillus subtilis

  • Bei dem weit verbreiteten, Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis handelt es sich um einen der am besten charakterisierten Organismen. Drei Faktoren haben insbesondere zur Etablierung von B. subtilis als Modellorganismus beigetragen: I.) die einfache genetische Manipulierbarkeit und Handhabung im Labor, II.) das Interesse an zellulären Differenzierungsprozessen wie der Bildung von Endosporen und III.) die biotechnologische Bedeutung von Bacillus-Arten. Deshalb sind die zellulären Komponenten, wie Proteine, Metabolite und regulatorische RNAs, und physiologischen Prozesse von B. subtilis, einschließlich seiner Anpassungsmechanismen an verschiedene Nährstoff- und Stressbedingungen, bereits sehr gut charakterisiert. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stand die Anpassung der Genexpression von B. subtilis an hyperosmotische Bedingungen, mit denen das Bakterium in seinen natürlichen Habitaten häufig konfrontiert ist. Die Konstruktion genomreduzierter Stämme ist ein Ansatz, die Interaktionen zwischen den zellulären Komponenten sowie die Funktion aller Proteine und funktionellen RNAs eines Organismus besser zu verstehen. Das MiniBacillus-Projekt verfolgt das Ziel, durch schrittweise Deletion aller nicht-essentiellen genomischen Regionen einen B. subtilis-Stamm zu entwickeln, der mit einem minimalen Set an Genen in komplexen Medien wachsen kann. In einer von der Arbeitsgruppe um Prof. J. Stülke (Georg-August-Universität Göttingen) koordinierten Studie erfolgte die bisher umfassendste Multi-Omics-basierte Charakterisierung von genomreduzierten Stämmen. Die zwei analysierten Stämme wiesen eine Genomreduzierung von ca. 35 % auf. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden das Transkriptom der Stämme im Vergleich zum Ausgangsstamm unter Verwendung von strangspezifischen Tiling-Arrays untersucht sowie phänotypische Merkmale der Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Studie lieferte wichtige Befunde zur Verteilung der zellulären Translationskapazität und zeigte beispielsweise, dass der Anteil der essentiellen Proteine am gesamten Proteom in den drei B. subtilis-Stämmen größer als 50 % ist, während Proteine mit unbekannter Funktion weniger als 3 % des Proteoms ausmachen. Weiterhin wurden die Auswirkungen der Deletionen auf die Genexpression und den Metabolismus untersucht, wobei sich die Unterschiede zwischen den genomreduzierten Stämmen und dem Ausgangsstamm zum größten Teil mit Veränderungen der Menge oder der Aktivität von Transkriptionsfaktoren erklären lassen. Die Multi-Omics-Studie trug nicht nur zum besseren Verständnis der zellulären Netzwerke bei, sondern identifizierte auch Ansatzpunkte für die gezielte Deletion weiterer genomischer Bereiche. Eine weitere Transkriptomanalyse wurde im Rahmen eines Projektes mit der Arbeitsgruppe um Prof. J. Stülke zur Charakterisierung der physiologischen Rolle des sekundären Botenstoffs c-di-AMP durchgeführt. c-di-AMP ist ein essentielles Signalnukleotid vieler Bakterien, das bei Gram-positiven Organismen eine wichtige Rolle bei der zellulären Kalium-Homöostase spielt, aber auch weitere Funktionen wie den Zellwandmetabolismus beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genexpressionsmuster des B. subtilis-Stammes 168 und einer Mutante, die c-di-AMP nicht abbauen kann, miteinander verglichen, um die Auswirkungen einer Akkumulation von c-di-AMP auf globaler Ebene zu untersuchen. Zu den stärksten Effekten gehörte die Repression der beiden Operons, die für die Biofilmbildung entscheidend sind. In weiteren Experimenten in Göttingen wurde mit einem nicht domestizierten Stamm gezeigt, dass B. subtilis bei hohen intrazellulären c-di-AMP-Konzentrationen keinen Biofilm ausbilden kann. Ebenfalls im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit der Arbeitsgruppe um Prof. J. Stülke wurde eine Transkriptomanalyse durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen Veränderungen der DNA-Topologie und dem Glutamatstoffwechsel von B. subtilis aufzuklären. Der Ausgangspunkt dieser Analyse waren Studien der Göttinger Arbeitsgruppe zum zentralen Regulator der Kohlenstoff-Katabolitenrepression, CcpA, dessen Inaktivierung dazu führt, dass B. subtilis Glutamat nicht selbst synthetisieren kann. Die Ursache dafür ist die konstitutive Expression des rocG-Gens, das einen negativen Effektor des Transkriptionsaktivators GltC kodiert. Bestimmte Supressormutanten, die ohne Zugabe von Glutamat wachsen können, besitzen aufgrund einer Punktmutation im topA-Gen eine hyperaktive Form der Topoisomerase I, die mit einer Reduktion des negativen DNA-Supercoilings verbunden ist. In der durchgeführten Transkriptomanalyse wurden mehr als 1100 Gene identifiziert, die in der ccpA topAhyper-Mutante eine im Vergleich zur ccpA-Mutante veränderte Expression aufwiesen. Die damit verbundenen Auswirkungen auf das metabolische Netzwerk von B. subtilis führen dazu, dass RocG seine regulatorische Funktion nicht mehr ausüben kann und GltC dadurch in der Lage ist, die Transkription des Glutamat-Biosynthese-Operons gltAB zu aktivieren. Insgesamt hat die Studie Verbindungen zwischen der DNA-Topologie und dem metabolischen Netzwerk gezeigt, die unter physiologischen und biotechnologischen Aspekten von Interesse sind. Um ein Absinken des Turgors unter hyperosmotischen Bedingungen zu vermeiden, akkumulieren Bakterien kompatible Solute im Zytoplasma. B. subtilis kann mit Hilfe von fünf osmotisch induzierbaren Aufnahmesystemen (OpuA bis OpuE, engl. osmostress protectant uptake) mindestens 15 verschiedene osmoprotektive Substanzen aus der Umgebung aufnehmen. Die aus einem Genduplikationsereignis hervorgegangenen Transporter OpuB und OpuC weisen eine Sequenzhomologie von über 70 % auf, unterscheiden sich aber dennoch deutlich hinsichtlich ihres Substratspektrums. Während OpuB weitgehend spezifisch für das Glycin-Betain-Vorläufermolekül Cholin ist, kann der OpuC-Transporter eine Vielzahl an verschiedenen Substanzen, einschließlich Glycin-Betain und Cholin, aufnehmen. Für das opuB-Operon wurde in einer vorangegangenen Transkriptomstudie ein Antisense-Transkript mit der Bezeichnung S1290 identifiziert, welches eine starke transiente Induktion nach Einwirkung eines Salzschocks zeigte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die bioinformatisch vorhergesagte Abhängigkeit der S1290-Expression vom alternativen RNA-Polymerase-Sigmafaktor SigB, dem zentralen Regulator der generellen Stressantwort von B. subtilis, experimentell bestätigt und die potentielle regulatorische Rolle der asRNA (engl. antisense RNA) untersucht. Es wurde gezeigt, dass die S1290-asRNA für die zeitlich verzögerte Induktion von opuB nach einem Salzschock verantwortlich ist. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass B. subtilis die effektive Nutzung der vorhandenen osmoprotektiven Substanzen und der energetischen Ressourcen erreicht, indem zunächst vorrangig die Gene induziert werden, die für den relativ unspezifischen OpuC-Transporter kodieren, und erst danach die Synthese des Cholin-spezifischen Transporters OpuB aktiviert wird. Neben der Akkumulation von osmoprotektiven Substanzen sind andauernde hyperosmotische Bedingungen mit vielen weiteren Veränderungen der Genexpression und Physiologie von B. subtilis verbunden. Dazu zählen unter anderem Veränderungen im Zellwandmetabolismus, die Induktion einer Eisenlimitationsantwort, eine reduzierte Motilität und die Unterdrückung der Sporulation. Um zusätzliche Facetten der Anpassung von B. subtilis an ein kontinuierliches Wachstum unter hyperosmotischen Bedingungen aufzudecken, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit eine globale Analyse des Transkriptoms unter Verwendung strangspezifischer Tiling-Arrays. Der Vergleich der Transkriptmengen unter Hochsalzbedingungen (1,2 M NaCl) und unter Standardbedingungen zeigte Veränderungen der Expression von mehr als einem Viertel der proteinkodierenden Gene sowie zahlreicher nicht-kodierender RNAs. Es wurden bisher nicht bekannte Anpassungsreaktionen von B. subtilis an hyperosmotische Bedingungen identifiziert, wie beispielsweise eine anhaltende nicht-maximale Induktion des SigB-Regulons und eine erhöhte Expression CymR-abhängiger Gene. Ein weiteres Ergebnis der durchgeführten Studie war, dass eine hohe Osmolarität der Umgebung nicht nur die Motilität der B. subtilis-Zellen negativ beeinflusst, sondern auch zu einer stark verringerten Biofilmbildung führt. Die Akkumulation von osmoprotektiven Substanzen wie Glycin-Betain wirkt der Dehydrierung des Zytoplasmas entgegen, kann aber zelluläre Prozesse auch durch eine stabilisierende Wirkung auf Proteine und Nukleinsäuren beeinflussen. Die genomweiten Effekte von Glycin-Betain auf die Genexpression von B. subtilis wurden in dieser Arbeit zum ersten Mal untersucht. In Gegenwart von 1,2 M NaCl und 1 mM Glycin-Betain wiesen 40 % der Gene, die unter Hochsalzbedingungen im Vergleich zur Kontrolle induziert waren, eine signifikant verringerte Expression auf. Darunter befanden sich Gene, die für Opu-Aufnahmesysteme kodieren, sowie viele Gene des SigB-Regulons. Demgegenüber wird die bei hohen Salzkonzentrationen unterdrückte Expression der Sporulationsgene durch die Supplementation des Mediums mit Glycin-Betain nicht aufgehoben. Die Transkriptmengen von 150 Genen waren durch Glycin-Betain sowohl unter Hochsalz- als auch unter Kontrollbedingungen beeinflusst. Mit dieser Studie wurden umfassende Daten zur Genexpression von B. subtilis unter hyperosmotischen Bedingungen generiert, wodurch neue Facetten der zellulären Anpassung sowie globale Effekte der osmoprotektiven Substanz Glycin-Betain aufgedeckt werden konnten.
  • The soil-living, Gram-positive bacterium Bacillus subtilis is one of the best-characterized organisms. Three factors have, in particular, contributed to the establishment of B. subtilis as a model organism: I.) the ease of genetic manipulation and handling in the laboratory, II.) the interest in cellular differentiation processes, such as formation of endospores and III.) the biotechnological importance of Bacillus species. Therefore, the cellular components, such as proteins, metabolites and regulatory RNAs, and physiological processes of B. subtilis, including its adaptation mechanisms to different nutrient and stress conditions, are already well characterized. The focus of the present work was the adaptation of gene expression of B. subtilis to hyperosmotic conditions with which the bacterium is frequently confronted in its natural habitats. The construction of genome-reduced strains is one approach to better understand the interactions between cellular components and the functions of all proteins and functional RNAs of an organism. The MiniBacillus project aims to develop a B. subtilis strain that can grow in complex media with a minimal set of genes by gradually deleting all non-essential genomic regions. In a study coordinated by the research group of Prof. J. Stülke (Georg-August-University of Göttingen), the most comprehensive multi-omics based characterization of genome-reduced strains to date was performed. The two analyzed strains displayed a genome reduction of about 35 %. In the present thesis, the transcriptome of the strains was examined in comparison to the parental strain using strand-specific tiling arrays and phenotypic characteristics of the cells were examined by fluorescence microscopy. The study provided important findings on the distribution of cellular translation capacity, showing, for example, that the proportion of essential proteins in the total proteome is greater than 50 % in the three B. subtilis strains, while proteins with unknown functions account for less than 3 % of the proteome. Furthermore, the effects of the deletions on gene expression and metabolism were investigated. The differences between the genome-reduced strains and the parental strain could be explained largely by changes in the amount or activity of transcription factors. The multi-omics study not only contributed to a better understanding of the cellular networks, but also revealed new starting points for the targeted deletion of further genomic regions. A further transcriptome analysis was performed as part of a project conducted by the group of Prof. J. Stülke in order to characterize the physiological role of the secondary messenger c-di-AMP. c-di-AMP is an essential signal nucleotide in many bacteria, which plays an important role in cellular potassium homeostasis in Gram-positive organisms, but also influences other functions such as cell wall metabolism. In this thesis, gene expression patterns of B. subtilis strain 168 and a mutant that is unable to degrade c-di-AMP were compared to investigate the effects of c-di-AMP accumulation at the global level. One of the strongest effects was the repression of the two operons, which are crucial for biofilm formation. In further experiments performed with a non-domesticated strain in Göttingen, it was shown that B. subtilis is unable to form a biofilm at high intracellular c-di-AMP concentrations. Also in collaboration with the research group of Prof. J. Stülke, a transcriptome analysis to elucidate the relationship between changes in DNA topology and glutamate metabolism of B. subtilis was performed. This analysis started from previous studies by this group on the central regulator of carbon catabolite repression, CcpA, whose inactivation leads to the inability of B. subtilis to synthesize glutamate. This is due to the constitutive expression of the rocG gene encoding a negative effector of the transcription activator GltC. Certain suppressor mutants, which can grow without glutamate addition, possess a point mutation in the topA gene leading to a hyperactive form of topoisomerase I, which is associated with a relaxation of negative DNA supercoiling. In the transcriptome analysis, more than 1100 genes were identified that exhibited altered expression in the ccpA topAhyper mutant compared to the ccpA mutant. Due to the resulting effects on the metabolic network of B. subtilis, RocG is no longer able to perform its regulatory function and GltC can therefore activate the transcription of the glutamate biosynthesis operon gltAB. Overall, the study showed connections between DNA topology and the metabolic network, which are of interest from a physiological and biotechnological point of view. To prevent a decrease of the turgor under hyperosmotic conditions, bacteria accumulate compatible solutes in the cytoplasm. B. subtilis can take up at least 15 different osmoprotective compounds from the environment via five osmotically inducible uptake systems (OpuA to OpuE, osmostress protectant uptake). The transporters OpuB and OpuC evolved through a gene duplication event and show a sequence homology of more than 70 %, but nevertheless possess strikingly different substrate specificities. While OpuB is largely specific for the glycine betaine precursor molecule choline, the OpuC transporter can take up a variety of different substances, including glycine betaine and choline. For the opuB operon, an antisense transcript called S1290 was identified in a previous transcriptome study, which showed a strong transient expression in response to a suddenly imposed salt stress. In the present work, the bioinformatically predicted control of S1290 expression by the alternative RNA polymerase sigma factor SigB, the central regulator of the general stress response of B. subtilis, was experimentally confirmed. Our studies on the potential regulatory role of this antisense RNA revealed that the S1290 RNA is responsible for the time-delayed osmotic induction of opuB after salt shock. These results suggest that B. subtilis accomplish the effective use of the available osmoprotective substances and energetic resources by initially inducing the genes encoding for the promiscuous OpuC transporter and only then activating the synthesis of the choline-specific transporter OpuB. In addition to the accumulation of osmoprotective compounds, sustained high-osmolarity conditions are associated with many other changes in gene expression and physiology of B. subtilis. These include changes in cell wall metabolism, induction of an iron limitation response, reduced motility and suppression of sporulation. In order to reveal additional facets of the adaptation of B. subtilis to continuous growth under hyperosmotic conditions, a global analysis of the transcriptome using strand-specific tiling arrays was carried out. The comparison of the transcriptome under high salinity (1.2 M NaCl) and standard growth conditions revealed significant changes in the expression of more than one fourth of the protein-coding genes as well as numerous non-coding RNAs. Previously unidentified adaptation reactions of B. subtilis to hyperosmotic conditions included a sustained low-level induction of the SigB regulon and an increased expression of CymR-dependent genes. Furthermore, the study showed that a high-osmolarity environment not only negatively influences motility of B. subtilis cells but also leads to strongly reduced biofilm formation. The accumulation of osmoprotective substances, such as glycine betaine, counteracts the dehydration of the cytoplasm, but can also influence cellular processes by stabilizing proteins and nucleic acids. The genome-wide effects of glycine betaine on gene expression of B. subtilis were investigated for the first time in this work. In the presence of 1.2 M NaCl and 1 mM glycine betaine, 40 % of the genes induced under high-salinity compared to control conditions showed significantly reduced expression. These included genes coding for the Opu uptake systems and many genes of the SigB regulon. In contrast, reduced expression of sporulation genes during growth under sustained high-salinity conditions was not reversed in the presence of glycine betaine. Analysis of the effects of glycine betaine that are independent of growth medium salinity revealed that mRNA levels of 150 genes were altered by the supplementation of the medium with glycine betaine under both high-salt and control conditions. Overall, this study generated comprehensive data on gene expression of B. subtilis under hyperosmotic conditions, revealing new facets of cellular adaptation as well as global effects of the osmoprotective compound glycine betaine.

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Metadaten
Author: Hermann Rath
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-38610
Title Additional (English):Identification of new components of the regulatory network of Bacillus subtilis
Referee:Prof. Dr. Uwe Völker, Prof. Dr. Gert Bange
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/07/20
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/06/29
Release Date:2020/07/20
GND Keyword:Bacillus subtilis, Genregulation, Transkriptomanalyse
Pagenumber:115
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie