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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-38731

Characterization of recombinant laccase from Trametes versicolor synthesized by Arxula adeninivorans and its application in enzymatic removal of pharmaceuticals from wastewater

  • In recent years, negative impact of pharmaceutical products on natural environment became an issue of high public interest. Pharmaceutical residues are detected in various ecosystems worldwide. Due to increasing production and consumption of medicines this problem is intensified. Therefore, an efficient way to restrain release into the world’s water system is required. This work presents an enzymatic approach for the degradation of pharmaceuticals in wastewater treatment plants, using laccase and cytochrome P450 — two enzymes of high biotechnological and industrial potential. Laccase genes from fungi Trametes versicolor and Pycnoporus cinnabarinus were isolated and overexpressed in the non-conventional yeast Arxula adeninivorans. This organism served also as cytochrome P450 gene donor. Recombinant laccase Tvlcc5 was purified by immobilized-metal ion affinity chromatography and biochemically characterized using 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) as substrate for enzyme activity assays. The optimal temperature and pH were found to be 50 °C and 4.5–5.5, respectively. The half-life of Tvlcc5 at 60 °C was around 20 min. It was demonstrated that the presence of copper ions is essential for the synthesis of active protein. Moreover, negative impact of chloride anions on laccase activity was shown. Cultivation conditions for the Tvlcc5 producing strain A. adeninivorans G1212/YRC102-TEF1-TVLCC5-6H were optimized. It was found that maintaining the pH at a constant level between pH 6.0 and 7.0 is essential for the production of active enzyme. Optimal cell growth and laccase accumulation were reached at 20 °C and in medium supplemented with 0.5 mM CuSO4. Performed fed-batch cultivation resulted in a laccase activity of 4986.3 U L-1. Factors influencing the synthesis of Tvlcc5 leading to increased production of this protein were investigated. It was found that using three non-native signal peptides (cutinase 2 from A. adeninivorans (ACut2), α-mating factor from S. cerevisiae (MFα), and acid phosphatase from P. pastoris (PHO1) signal peptides) enhances the secretion of active enzyme by 20–80%. Besides that, additional overexpression of copper transporters positively affects laccase production. Finally, it was proven that recombinant Tvlcc5 is a promising agent for the degradation of certain pharmaceuticals. After 24 h of incubation, the concentration of diclofenac and sulfamethoxazole decreased to 46.8% and 51.1%, respectively. Furthermore, it was shown that the addition of the redox mediator ABTS significantly shortens the degradation time of these substances.
  • In den letzten Jahren wurden die negativen Auswirkungen von Arzneimitteln auf die natürliche Umwelt zu einem Thema von hohem öffentlichen Interesse. Pharmazeutische Rückstände werden in verschiedenen Ökosystemen weltweit nachgewiesen. Durch die zunehmende Produktion und den Konsum von Medikamenten wird dieses Problem verstärkt. Daher ist eine effiziente Möglichkeit erforderlich, die Freisetzung in das weltweite Wassersystem zu beschränken. Diese Arbeit stellt einen enzymatischen Ansatz für den Abbau von Arzneimitteln in Kläranlagen unter Verwendung von Laccase und Cytochrom P450 – zwei Enzymen mit hohem biotechnologischen und industriellen Potenzial – dar. Laccase-Gene der Pilze Trametes versicolor und Pycnoporus cinnabarinus wurden isoliert und in der nicht-konventionellen Hefe Arxula adeninivorans überexprimiert. Dieser Organismus diente auch als Cytochrom P450 Gen-Donor. Die rekombinante Laccase Tvlcc5 wurde durch immobilisierte Ionenaffinitätschromato-graphie gereinigt und biochemisch mittels 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure) (ABTS) als Substrat charakterisiert. Die optimale Temperatur und der optimale pH-Wert lagen bei 50 °C bzw. 4,5 bis 5,5. Die Halbwertszeit von Tvlcc5 bei 60 °C betrug etwa 20 min. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von Kupferionen für die Synthese von aktivem Protein unerlässlich ist. Darüber hinaus wurden negative Auswirkungen von Chlorid-Anionen auf die Laccase-Aktivität nachgewiesen. Die Kultivierungsbedingungen für den Tvlcc5-Produktionsstamm A. adeninivorans G1212/YRC102-TEF1-TVLCC5-6H wurden optimiert. Es wurde festgestellt, dass die Aufrechterhaltung des pH-Werts auf konstantem Niveau zwischen pH 6,0 und 7,0 für die Produktion von aktivem Enzym unerlässlich ist. Optimales Zellwachstum und Laccase-Akkumulation wurde bei 20 °C in einem Medium, supplementiert durch 0,5 mM CuSO4, erreicht. In der Fed-Batch Kultivierung wurde eine Laccase-Aktivität von 4986,3 U L-1 erreicht. Es wurden Faktoren untersucht, die die Synthese von Tvlcc5 im Sinne einer erhöhten Produktivität beeinflussen. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von drei nicht nativen Signalpeptiden (Signalpeptide der Cutinase 2 von A. adeninivorans (ACut2), dem α-spezi¬fischen Paarungspheromon von S. cerevisiae (MFα) und der sauren Phosphatase von P. pastoris (PHO1)) die Sekretion des aktiven Enzyms jeweils um 20–80 % verbessert. Darüber hinaus wirkt sich eine zusätzliche Überexpression von Genen, die für Kupfertransportproteine codieren, positiv auf die Laccase-Produktion aus. Schließlich wurde nachgewiesen, dass das rekombinante Tvlcc5 ein vielversprechendes Mittel für den Abbau bestimmter Arzneimittel ist. Nach 24 h Inkubation sank die Konzentration von Diclofenac und Sulfamethoxazol auf 46,8 % bzw. 51,1 %. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Zugabe des Redox-Mediators ABTS die Abbauzeit dieser Substanzen erheblich verkürzt. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass Subtanzen wie Carbamazepin ohne den Einsatz eines Mediators durch Laccase allein nicht abgebaut werden können.

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Metadaten
Author: Katarzyna Litwińska
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-38731
Title Additional (German):Charakterisierung einer durch Arxula adeninivorans synthetisierten, rekombinanten Laccase von Trametes versicolor und deren Anwendung im enzymatischen Abbau von Pharmazeutika in Abwasser
Referee:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller, Prof. Dr. Vlada Urlacher
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/07/23
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/07/07
Release Date:2020/07/23
GND Keyword:Arxula adeninivorans, Degradation, Laccase, Pharmaceuticals
Pagenumber:140
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie