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Regulationsmechanismen der Wnt3A-induzierten Hypertrophie am Zellmodell der neonatalen Kardiomyozyten

  • Die linksventrikuläre Herzhypertrophie ist ein zentraler Vorhersageparameter für das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse. Durch eine permanent gesteigerte Belastung des Herzens kommt es dabei auf zellulärer Ebene zu Umbauprozessen, die mit einer Hypertrophie der einzelnen Kardiomyozyten einhergehen. An der prohypertrophen Signaltransduktion sind zahlreiche Signalwege beteiligt, deren jeweilige Bedeutung und Interaktion untereinander noch nicht ausreichend untersucht ist. Seit einiger Zeit ist bekannt, dass auch das Wnt-Signalling im adulten Herzen bei Schädigung reaktiviert werden kann. Auch wenn die Beteiligung vieler Mediatoren des Wnt-Signallings für die Hypertrophieentstehung bereits gezeigt werden konnte, ist es aufgrund der Interaktionen der verschiedenen Signalwege notwendig, den Effekt der Wnt-Proteine auf die Kardiomyozyten direkt nachzuweisen. Da sowohl eigene Voruntersuchungen als auch viele In-vivo-Studien an Mäusen des Stammes C57/BL6 durchgeführt wurden, sollten in dieser Arbeit die Wirkungen verschiedener Wnt-Proteine hinsichtlich Hypertrophie und Zellsignalling auf isolierte murine neonatale Kardiomyozyten untersucht werden. Dazu wurden zunächst der Isolationsprozess dieser Primärzellen etabliert und optimale Kultur- und Stimulationsprotokolle bestimmt. Anschließend wurde das Ausmaß der zellulären Hypertrophie immunfluoreszenzmikroskopisch mittels myozytenspezifischer Anfärbung von α-Actinin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine Isolation und Kultivierung der neonatalen Kardiomyozyten im Gewebeverband über eine längere Versuchsdauer von bis zu sieben Tagen möglich ist. Die Zellen waren reproduzierbar vital und wiesen stabil kontraktile Eigenschaften auf. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass diese Zellen bei Stimulation mit dem Wnt-Protein Wnt3A im Mangelmedium Panserin mit einer konzentrationsabhängigen Hypertrophie antworten, die dem bekannten prohypertrophen Stimulus Endothelin-1 sogar überlegen ist. Ein zweiter Teil der Arbeit beschäftigte sich mit spezifischen Signalwegen, die von verschiedenen Wnt-Proteinen angesprochen werden können. Dabei wurden sowohl Veränderungen von Kinaseaktivitäten wie der AKT und der GSK-3β als auch Proteinakkumulationen wie die von β-Catenin untersucht. Auch Kerntranslokationen der Transkriptionsfaktoren β-Catenin und NFAT c1 – c4 wurden überprüft. Leider konnten an den neonatalen Mauskardiomyozyten keine Wnt-induzierten Veränderungen von Enzymaktivitäten bzw. veränderte Lokalisierungen einzelner Transkriptionsfaktoren nachgewiesen werden. Einzig ein detektierbarer Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentrationen, der aber gegenüber unstimulierten Zellen keine Signifikanz erreichte, könnte auf eine mögliche Beteiligung des Wnt/Ca2+-Weges hindeuten.
  • Left ventricular hypertrophy is a key predictive parameter for the occurrence of cardiovascular disorders. A permanently increased load on the heart triggers restructuring processes at the cellular level, which are accompanied by hypertrophy of the individual cardiomyocytes. Numerous signaling pathways are involved in prohypertrophic signal transduction, however there are still many unknowns about the significance and interaction of these pathways and require an in depth investigation. It has been known for some time that Wnt signaling can also be reactivated in the adult heart if it is damaged. Even if the involvement of many mediators of Wnt signaling for the development of hypertrophy has already been shown, it is necessary, due to the interactions of the various signaling pathways, to demonstrate the effect of the Wnt proteins on the cardiomyocytes directly. For our study, we used mice of the strain C57/BL6 to keep our methods consistent with our preliminary work. Secondly prior hypertrophy studies have been conducted using C57/BL6 mice for in vivo investigations. For this in an initial step we carried out the isolation of murine neonatal cardiomyocytes through different methods and determined the best suited method for cultivation and preservation of the cellular culture. Subsequently we developed protocols for stimulations with proteins for hypertrophy and cell signaling. The extent of the cellular hypertrophy was then examined by immunofluorescence microscopy using myocyte-specific staining of α-actinin. We observed that the isolation and cultivation of the neonatal cardiomyocytes in the tissue association is possible over a longer test period of up to seven days. Through various iterations we found the cells to be vital with stable contractile properties. In addition, we observed that these cells responded to stimulation with the protein Wnt3A in the nutrient deficient medium panserin, with a concentration-dependent hypertrophy that is even superior to the known prohypertrophic stimulus endothelin-1. In the second part of our investigation we dealt with specific signaling pathways that can be addressed by different Wnt proteins. We researched both the changes, 1) in kinase activities such as the AKT and GSK-3β and 2) in protein accumulations such as that of β-catenin. Furthermore we also checked nuclear translocations of the transcription factors β-catenin and NFAT c1 - c4. We did not note Wnt-induced changes in enzyme activities nor changed localizations of individual transcription factors in the neonatal mouse cardiomyocytes. We only detected a moderate increase in the intracellular calcium concentration, which did not reach a statistical significance compared to unstimulated cells. This might indicate a possible involvement of the Wnt/Ca2+ pathway and requires further investigation.

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Metadaten
Author: Anne Wustmann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-41059
Title Additional (German):Mechanisms of regulation of Wnt3A-induced hypertrophy in neonatal cardiomyocytes
Referee:Prof. Dr. med. Stephan Felix, Prof. Dr. med. Benjamin Meder
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/11/19
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2020/10/01
Release Date:2020/11/19
Tag:Wnt-Signalling, Wnt3A, neonatale Kardiomyozyten
GND Keyword:Herz, Herzmuskelzelle, Hypertrophie, Maus, in vitro
Pagenumber:86
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Innere Medizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit