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Characterization of Puumala Orthohantavirus - Host Interactions: From the Field to the Bench

  • Orthohantaviruses are rodent-borne pathogens distributed all over the world, which do not cause visible disease in their reservoir host. Puumala orthohantavirus (PUUV) causes most human hantavirus disease cases in Europe and is transmitted by the bank vole (Clethrionomys glareolus). Hantaviruses have a tri-segmented genome consisting of the large (L) segment, coding for the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), the medium (M) segment, encoding the glycoproteins, and the small (S) segment. The S-segment contains two major overlapping open reading frames (ORF) coding for the nucleocapsid (N) protein and a non-structural (NSs) protein, a putative type I interferon (IFN-I) antagonist. To date, pathogenesis and reservoir host adaptation of hantaviruses are poorly understood due to missing adequate cell culture and animal models. In contrast to previous studies, in this work, data from spring and summer 2019 indicated a high vole abundance, a high PUUV prevalence in voles and high human incidence for some endemic regions in Germany, but elsewhere values were low to moderate. Regional and local human health institutions need to be aware about the heterogeneous distribution of human PUUV infection risk. For a better understanding of virus-host associations, two novel cell lines from bank voles and common voles each were generated and their susceptibility and replication capacities for a variety of zoonotic and non-zoonotic viruses were analyzed. The PUUV strain Vranica/Hällnäs showed efficient replication in a new bank vole kidney cell line, but not in four other cell lines of bank and common voles. Vice versa, Tula orthohantavirus (TULV) replicated in the kidney cell line of common voles, but was hampered in its replication in other cell lines. Several viruses, such as Cowpox virus, Vaccinia virus, Rift Valley fever virus, and Encephalomyocarditis virus 1 replicated in all four cell lines. West Nile virus, Usutu virus, Sindbis virus and Tick-borne encephalitis virus replicated only in a part of the cell lines. These results indicate a tissue or species specific tropism for many of the tested viruses and the potential value of vole cell lines to address such questions in detail. Using one of these new cell lines, the first German PUUV strains were isolated from bank voles caught in the highly endemic region around Osnabrück. Complete genomes were determined by target-enrichment-mediated high-throughput sequencing from original lung tissue, after isolation and after additional passaging in VeroE6 cells and a bank vole-derived kidney cell line. Different single amino acid substitutions were observed in the RdRP of the two stable PUUV isolates. The PUUV strain isolated on VeroE6 cells showed a lower titer when propagated on bank vole cells compared to VeroE6 cells. Additionally, glycoprotein precursor (GPC)-derived virus-like particles of a German PUUV strain from the same region allowed the generation of monoclonal antibodies that reacted with the isolated PUUV strains. To investigate the role of PUUV and other vole-borne hantavirus NSs proteins, the evolution of the NSs and N encoding sequences was investigated by a field study in bank voles and the NSs sequences were characterized in vitro for their inhibitory effect on the human interferon-β promoter. Analysis of blood and lung samples of 851 bank voles trapped during 2010-2014 in Baden-Wuerttemberg and North Rhine-Westphalia resulted in detection of 27.8% PUUV-specific antibody positive bank voles, whereas in 22.3% PUUV-specific RNA was detected. In the hantavirus outbreak years 2010 and 2012 PUUV prevalence in bank voles was higher compared to 2011, 2013 and 2014. Sequences of the S segment of all positive bank voles showed amino acid and nucleotide sequence types of the NSs-ORF with temporal and/or local variation, whereas the N-ORF was highly conserved. One sequence type persisted over the whole observation period in both regions. The NSs coding sequence was highly divergent among regional bank vole populations in the outbreak year 2012. Transfection experiments resulted in the detection of different products of the NSs-ORF of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses, due to translation initiation at different methionine codons along the coding sequence. Using luciferase reporter assays, the NSs proteins of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses showed inhibition of IFN-I induction of up to 70%, whereas Sin Nombre and Andes orthohantavirus NSs proteins showed a reduced effect compared to the other NSs proteins. The first 20 amino acids of the N-terminal region of PUUV NSs were found to be crucial for IFN-I promoter inhibition. In conclusion, the newly established cell lines, antibodies, reporter assays and PUUV isolates are highly valuable tools for future hantavirus research. The activity of PUUV NSs protein in human cells contributes to our understanding of virus-host interactions and highlights the importance of corresponding future reservoir host studies. Hantavirus surveillance studies showed the necessity for timely information of the potential human PUUV infection risk to public health institutions in endemic areas to initiate appropriate actions.
  • Orthohantaviren sind Nagetier-assoziierte Viren, die weltweit verbreitet sind und in ihrem Reservoirwirt keine symptomatische Erkrankung hervorrufen. Puumala-Orthohantavirus (PUUV) verursacht in Europa die meisten Hantavirus-Erkrankungen und wird von der Rötelmaus (Clethrionomys glareolus) übertragen. Das Genom von Hantaviren ist in drei Segmente gegliedert: das große (L) Segment (kodiert die RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRP)), das mittlere (M) Segment (kodiert die Glykoproteine), und das kleine (S) Segment. Das S Segment enthält zwei überlappende offene Leserahmen (ORF). Diese exprimieren ein Nukleokapsidprotein (N) und ein Nicht-Struktur (NSs) Protein, einen potentiellen Typ I-Interferon (IFN-I)-Antagonisten. Bis heute ist über die Pathogenese und Anpassung von Hantaviren an ihren Wirt nur wenig bekannt, was auch daran liegt, dass es keine adäquaten Zellkultur- oder Tiermodelle gibt. Im Gegensatz zu den genannten früheren Daten zeigten die Untersuchungen von Rötelmäusen aus dem Frühling und Sommer 2019 in dieser Arbeit eine hohe Abundanz an Rötelmäusen und PUUV Prävalenz in Rötelmäusen, sowie eine hohe humane Inzidenz in manchen Endemiegebieten Deutschlands, wohingegen diese Werte in anderen Endemieregionen niedrig waren. Regionale und lokale Gesundheitsämter müssen über das heterogen verteilte Gesundheitsrisiko für die Bevölkerung informiert werden. Zum besseren Verständnis von Virus-Wirt-Interaktionen wurden in dieser Arbeit neue Zelllinien von Rötel- und Feldmäusen etabliert und auf ihre Suszeptibilität und Replikationsfähigkeit für verschiedene zoonotische und nicht-zoonotische Viren getestet. Der PUUV-Stamm Vranica/Hällnäs replizierte sehr effektiv in nur einer der neuen Rötelmauszelllinien der Niere, aber nicht in den anderen vier untersuchten Rötelmaus- und Feldmauszelllinien. Tula-Orthohantavirus (TULV) hingegen replizierte in Nierenzellen der Feldmaus, aber war in den anderen Zelllinien von Rötel- und Feldmaus stark eingeschränkt. Einige Viren, darunter Kuhpockenvirus, Vaccinia-Virus, Rifttal Fieber-Virus und Enzephalomyokarditis-Virus 1, zeigten in allen Zelllinien eine effektive Replikation, wohingegen sich West Nil-Virus, Usutu-Virus, Sindbis-Virus und Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus nur in einem Teil der Zelllinien vermehren ließen. Diese Ergebnisse lassen einen Spezies- und Gewebe-spezifischen Tropismus für viele der untersuchten Viren vermuten und zeigen, die Bedeutung der Wühlmaus-Zelllinien für zukünftige detaillierte Untersuchungen zu diesen Fragen. Mit Hilfe einer der neuen Rötelmauszelllinien, konnten die ersten deutschen PUUV-Isolate aus Rötelmäusen isoliert werden, die in der Hochendemieregion um Osnabrück gefangen worden sind. Mit Hilfe einer Target-Enrichment-vermittelten High-Throughput-Sequencing-Technologie wurden PUUV-Komplettgenome für das zugrundeliegende Originalmaterial der Lunge, nach der Isolation und nach Passagieren in VeroE6-Zellen und Rötelmaus-Nierenzellen bestimmt und miteinander verglichen. Hier wurden einzelne Aminosäureaustausche in der RdRP nach Anzucht bei beiden stabilen Isolaten beobachtet. Ein Isolat aus VeroE6-Zellen, zeigte nach weiteren Passagen auf Rötelmauszellen einen niedrigeren Titer als nach Passage auf VeroE6-Zellen. Außerdem wurden mit Hilfe von virusähnlichen Partikeln, basierend auf der Sequenz für den Glykoprotein-Vorläufer (GPC) eines deutschen PUUV-Stammes aus der gleichen Region, monoklonale Antikörper hergestellt, die mit den neuen Isolaten reagierten. Zur Analyse des NSs-Proteins von PUUV und anderen Hantaviren wurde zunächst im Rahmen einer Feldstudie die Evolution von NSs- und N-kodierenden Sequenzen des PUUV aus Rötelmäusen untersucht und die NSs-Sequenzen durch in vitro-Studien auf ihren inhibitorischen Einfluss auf den IFN-β Promoter untersucht. Die Analyse von Blut- und Lungenproben von 851 in Baden-Württemberg und Nordrhein-Westfalen in den Jahren 2010-2014 gefangenen Rötelmäusen, zeigte 27.8% positive Rötelmäuse für PUUV-spezifische Antikörper und 22.3% positive Tiere für PUUV-RNA. In den Hantavirus-Ausbruchsjahren 2010 und 2012 war die PUUV-Prävalenz in Rötelmäusen höher als 2011, 2013 und 2014. S-Segment-Sequenzen von allen positiven Tieren zeigten Aminosäure- und DNA-Sequenztypen des NSs-offenen Leserahmens (ORF), die zeitlich und örtlich variierten, wohingegen der N-ORF hoch konserviert war. Ein Sequenztyp pro Fangort dominierte über die gesamte Beobachtungsperiode. Der NSs-ORF unterschied sich stark zwischen PUUV-Stämmen in den regionalen Rötelmauspopulationen im Ausbruchsjahr 2012. Mittels molekularbiologischer Analysen rekombinanter NSs-Proteine, wurden Expressionsprodukte von drei internen Initiationskodons im NSs identifiziert. Mittels Luziferase-Reporter-Assay wurde die Inhibition von IFN-I durch NSs-Proteine verschiedener Hantaviren bestimmt. PUUV, TULV, Prospect Hill- und Khabarovsk-Orthohantavirus NSs inhibierten die IFN-I-Induktion um bis zu 70%. Sin Nombre- und Andes-Orthohantavirus-NSs Proteine zeigten dagegen einen geringeren Effekt im Vergleich zu den anderen NSs Proteinen. Die 20 N-terminalen Aminosäuren des PUUV-NSs-Proteins stellten sich als besonders wichtig für die Hemmung des IFN-I-Promoters heraus. Zusammenfassend sind die hier neu eingeführten Zelllinien, Antikörper, Reporter-Assays und PUUV-Isolate wertvolle neue Werkzeuge für die zukünftige Hantavirusforschung. Der Nachweis der Aktivität des NSs-Proteins von PUUV in humanen Zellen trägt zum Verständnis der Virus-Wirt-Interaktionen im Fehlwirt Mensch bei und unterstreicht die Notwendigkeit zukünftiger Studien in einem Rötelmaussystem. Die Surveillancestudien zeigten die Notwendigkeit der zeitnahen Weitergabe von Informationen zum potentiellen Infektionsrisiko der Bevölkerung in Endemiegebieten zur Einleitung geeigneter Gegenmaßnahmen.

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Metadaten
Author:M.Sc Florian Binder
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-46637
Title Additional (German):Charakterisierung der Wirtsinteraktion von Puumala Orthohantavirus: Aus dem Feld ins Labor
Referee:Prof. Dr. Rainer G. Ulrich, Prof. Dr. Georg Kochs
Advisor:Prof. Dr. Rainer G. Ulrich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2021
Date of first Publication:2021/06/22
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2021/01/06
Release Date:2021/06/22
Tag:Interferon; NSs protein; Virus isolation; Zoonoses; bank vole
GND Keyword:Hantavirus, Clethrionomys glareolus, in-vitro Kultur
Page Number:165
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie