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Mechanismen der Immunzellsubversion in primären porzinen Monozyten nach Infektion mit hoch- und niedrig-virulenten ASPV-Stämmen

  • Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASPV) ist ein wirtschaftlich wichtiger und in Haus- und Wildschweinen Hämorrhagie mit hoher Sterblichkeitsrate verursachender viraler Erreger. 1921 erstmals in Kenia beschrieben, breitete sich die ASP seit 2007 auch über den Kaukasus, ins Baltikum (2014), weiter in europäische und asiatische Länder und seit 2020 in Deutschland aus. Trotz der hohen genetischen Stabilität des Afrikanischen Schweinepestvirus (ASPV) wurden Genomvarianten identifiziert, bei denen Unterschiede in der Genexpression von Multigenfamilien (MGF) dominieren. Letztlich divergieren ASPV-Stämme in ihrer Virulenz und verursachen akut-letale bis chronische Verläufe im Schwein. Aufgrund der enormen Komplexität des Virus und seiner vielfältigen Immunevasionsstrategien sind viele Mechanismen der Virus-Wirts-Interaktion, die zur Immunpathogenese beitragen, nicht ausreichend verstanden und erschweren somit die Impfstoffentwicklung. Dabei können virale Subversionsmechanismen der Wirtszelle die antivirale Immunantwort modulieren und stehen deshalb im Fokus dieser Arbeit. Zur Charakterisierung und mechanistischen Aufklärung dieser ASPV-spezifischen Immunsubversionsmechanismen wurden primäre porzine Monozyten von Hausschweinen mit hochvirulentem (Armenia) und natürlich-attenuiertem (Estonia) ASPV infiziert. Die Resultate ergaben sowohl stammunabhängige als auch -abhängige Unterschiede in der Regulation myeloider Oberflächenmarker infizierter Monozyten. Insbesondere beobachteten wir eine stammunabhängige Suppression des Phagozytose-regulierenden CD172a und eine stammabhängige Regulation von porzinem MHC I (SLA I). Weitere Experimente zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen ergaben, dass zwar beide Stämme die Oberflächenexpression von CD172 unterdrücken, jedoch nur Armenia-, im Gegensatz zu Estonia-infizierten Monozyten, eine reduzierte Recyclingrate sowie eine Abspaltung (Shedding) von CD172a von der Zelloberfläche zeigten. Dies lässt vermuten, dass die Virus-vermittelte Suppression von CD172a der beiden ASPV-Stämme auf unterschiedlichen Subversionsmechanismen beruht. Reinfektionsexperimente und molekularbiologische Untersuchungen belegten zudem, dass das abgespaltene Oberflächen-CD172a der Armenia-infizierten Monozyten mit einer gesteigerten Infektionsrate einhergeht, dies ist wahrscheinlich das Ergebnis (entweder direkt oder indirekt) einer Komplexbildung zwischen dem virulenten Armenia-Virus und löslichem CD172a. Im Gegensatz dazu resultierte die Infektion von Monozyten mit Armenia, jedoch nicht mit Estonia, in einem deutlichen Oberflächenverlust von porzinem SLA I, welches für die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T-Zellen essentiell ist. Weitere Versuche zeigten einen Reifungsdefekt von SLA I, der mit dem Abbau funktioneller ER-Strukturen und der Induktion von ER-Stress in Armenia-infizierten Monozyten in Zusammenhang stand. Gleichzeitig wurde eine deutlich reduzierte Überlebensfähigkeit Armenia-infizierter Monozyten beobachtet, die mit einem Verlust mitochondrialer Funktionen und der Bildung von Aggresomen aus fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma einherging. Vertiefende Analysen dazu zeigten einen Caspase-3 aktivierten Zelltodmechanismus und ein infektionsbedingtes, progressives Abschalten der Proteintranslation in Armenia-infizierten Zellen. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen den beobachteten Subversionsmechanismen und der Expression bestimmter viraler MGF-Gene zu finden, wurden weitere ASPV-Stämme in die Untersuchungen zur CD172a- und SLA I-Oberflächenexpression einbezogen. Ähnlich wie Armenia zeigte sich auch für die Stämme NHV und OURT88/3 eine deutliche Reduktion der SLA I-Oberflächenlevel, auch wenn diese in vivo gering-virulent sind. Andererseits zeigte das hochvirulente Benin97/1-Isolat im Gegensatz zu Armenia keine SLA I-Subversion, sondern ähnlich wie nach Estonia-Infektion kaum veränderte SLA I-Level, was vermuten lässt, dass der SLA I Subversionsmechanismus nicht alleinig den Virulenzgrad der ASPV-Stämme bestimmt. Ein direkter Genomvergleich identifizierte verschiedene Mitglieder der MGF110- und MGF505-Gene als möglicherweise beteiligte virale Genkandidaten. Im Gegensatz hierzu ergaben sich keine detektierbaren Unterschiede bei den Analysen zur Oberflächensuppression von CD172a innerhalb der verwendeten Isolate, wie bereits bei Armenia und Estonia Infektion beobachtet. Interessanterweise beobachteten wir dabei das Vorhandensein von MGF110-14 als eine genomische Gemeinsamkeit, die für die generelle Oberflächenreduktion von CD172a, zusätzlich zu anderen Genen, die ein Shedding und die Armenia-spezifische Interaktion bestimmen könnten, verantwortlich sein könnte. Insgesamt zeigen die Resultate dieser Arbeit erstmals, dass das virulente ASPV Armenia, anders als das attenuierte ASPV Estonia, einen ausgeprägten Funktions- und Vitalitätsverlust in seinen primären Zielzellen (z. B. Monozyten) bewirkt. Die gesteigerte Infektiosität, Induktion von zellulärem Stress und Beeinträchtigung der SLA I-vermittelten Antigenpräsentation werden in infizierten Schweinen eine entscheidende Rolle in der Virus-Verbreitung und der Immunevasion spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Befunde dieser Arbeit neue und vertiefte Einblicke in die zellulären Mechanismen der SLA I- und CD172a-Subversion im Zusammenhang mit der Immunevasion durch hoch-virulentes ASPV Armenia und attenuiertes ASPV Estonia gibt und zudem wichtig für das bessere Verständnis der ASP-Immunpathogenese sind.
  • African Swine Fever Virus (ASFV) is an economically important emerging viral pathogen that causes hemorrhagic disease with high case fatality rates in domestic pigs and wild boar. First described in Kenya in 1921, ASF has been spreading across the Caucasus since 2007, and more recently into the Baltic States (2014), further into European and Asian countries, and into Germany (since 2020). Despite the high genetic stability of ASFV, genome variants have been identified, and these predominantly show differences in gene expression from multigene families (MGFs). Ultimately, ASFV strains also vary in their virulence and can cause disease courses in pigs that range from acute-lethal to chronic. Due to the enormous complexity of the virus and its diverse immune evasion strategies, many of the virus-host interaction mechanisms that contribute to immunopathogenesis are poorly understood, and this complicates vaccine development. In particular, viral subversion mechanisms of the host cell can modulate the antiviral immune response and are therefore the focus of this work. In order to characterize and elucidate in-depth mechanistic details of ASFV-specific immune subversion mechanisms primary porcine monocytes from domestic pigs were infected with either highly virulent (Armenia) or naturally-attenuated (Estonia) strains of ASFV. The results revealed both strain-independent and strain-dependent differences in the regulation of myeloid surface markers. Specifically, we observed strain-independent suppression of phagocytosis-regulating CD172a and strain-dependent regulation of porcine-specific MHC I (SLA I). Further experiments investigating the underlying mechanisms revealed that, while both strains suppress surface expression of CD172, Armenia-infected, but not Estonia-infected, monocytes showed a reduced recycling rate for CD172a, as well as shedding of CD172a from the cell surface. This suggests that virus-mediated suppression of CD172a by these two ASFV strains is due to different subversion mechanisms. Reinfection experiments combined with molecular biological analyses further demonstrated that soluble CD172a from Armenia-infected monocytes is associated with increased infection rates, and that this is likely a result (either directly or indirectly) of complex formation between the virulent Armenia virus and soluble CD172a. In contrast to CD172a, which was regulated in a strain-independent manner, only Armenia-infected, but not Estonia-infected, monocytes revealed a marked loss of porcine-specific MHC I (SLA I), which is important for antigen presentation to CD8+ T cells. Further experiments demonstrated a maturation defect of SLA I that was related to the degradation of functional ER structures and the induction of transient ER stress in Armenia-infected monocytes. At the same time, a marked loss of viability of these Armenia-infected monocytes was detected, which was accompanied by the loss of mitochondrial function and the formation of unfolded protein-containing aggresomes in the cytoplasm. In-depth analyses indicated a caspase-3 activated cell death mechanism and showed a progressive infection-induced silencing of protein translation in Armenia-infected cells. To verify a possible correlation between the described subversion mechanisms and the expression of specific MGF genes, additional differentially virulent ASFV strains were included in the SLA I and CD172a surface expression studies. Similar to Armenia, although low virulent in vivo, the strains NHV and OURT88/3 showed a significant downregulation of SLA I. On the other hand, unlike Armenia, the highly virulent Benin97/1 isolate showed a lack of SLA I subversion, as seen for Estonia, which indicates that this SLA I subversion mechanism alone does not determine the virulence of the ASFV strain. A genome comparison identified several members of the MGF110 and MGF505 gene families as potentially being involved. In contrast, there were no differences in suppression of CD172a surface expression observed among the ASFV strains as already seen for Armenia und Estonia. Interestingly, we observed the presence of MGF110-14 as a genomic commonality that could be responsible for the overall downregulation of surface-bound CD172a, besides the Armenia-specific shedding and virus-CD172a-interaction which could be due to other genes. Overall, the results of this thesis show that Armenia, unlike Estonia, causes significant loss of function and viability in its primary target cells (i. e. monocytes). The increased infectivity, induction of cell stress, and impairment of SLA I-mediated antigen presentation play a critical role in virus dissemination and immune evasion by ASFV in infected pigs. In summary, these results provide new insights into mechanisms of SLA I and CD172a regulation in the context of immune evasion by highly virulent Armenia and naturally attenuated Estonia strains, and thereby advance our understanding ASFV immunopathogenesis.

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Metadaten
Author: Luise Hartmann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-83542
Title Additional (German):Immune cell subversion mechanisms in primary porcine monocytes upon infection with high or low virulent ASFV
Referee:PD Dr. Michael R. Knittler, PD Dr. Friederike Ebner
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, PD Dr. Sandra Blome, PD Dr. Michael R. Knittler, Dr. Ulrike Blohm
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2023
Date of first Publication:2023/05/09
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2023/02/16
Release Date:2023/05/09
Tag:ASFV; Flow cytometry; Immune subversion; Monocytes; SIRPa; SLA I
GND Keyword:Afrikanische Schweinepest, Durchflusscytometrie, Monozyt, Immunologie, Schwein, MHC
Page Number:191
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie