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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002670-8

Molekulare Mechanismen der Membranfusion bei Herpesviren - Einfluss spezifischer Mutationen in den Pseudorabies Virus Glykoproteinen B, H und D auf die Fusionsaktivität

  • Die Glykoproteine gB und gH-gL sind bei allen Herpesviren konserviert und wichtig für den Viruseintritt und die direkte Zell-Zell-Ausbreitung. Allerdings kann sich PrV in Abwesenheit von gL noch in einem sehr geringen Ausmaß von Zelle zu Zelle ausbreiten, was Reversionsanalysen durch serielle Zellkultur-Passagen einer gL-negativen PrV-Mutante erlaubt. So konnte in einem Passageexperiment die Revertante PrV-ΔgLPassB4.1 isoliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen der gL-unabhängigen Infektiosität von PrV-ΔgLPassB4.1 untersucht. Dabei wurden Mutationen in den Glykoproteinen gB, gH und gD nachgewiesen und deren Auswirkung auf die Proteinfunktion mit Hilfe von transienten Transfektions-Fusionsassays untersucht. Die Aufklärung der Kristallstrukturen eröffnete die Möglichkeit, über zielgerichtete Mutagenese die Funktion von gH-gL besser zu analysieren. Erstaunlich war, dass im gH des Impfstammes PrV-Bartha ein ansonsten hochkonserviertes Prolin durch Serin ersetzt ist. Für dieses Prolin wurde postuliert, dass es für die Ausbildung einer ebenfalls bei allen Herpesviren konservierten Disulfidbrücke notwendig ist. Um den Effekt der Substitution und die Funktion der Disulfidbrücke zu testen, wurden gH Mutanten hergestellt, die entweder Prolin oder Serin an Position 438 oder Serin statt Cystein an Position 404 exprimierten. Diese wurden in transienten Transfektions-Fusionsassays sowie während einer Virusinfektion getestet. Obwohl die Aminosäuresequenzen der gH-Proteine der Herpesviren nur eine geringe Homologie aufweisen, sind die Kristallstrukturen erstaunlich ähnlich. Daher sind konservierte Strukturmotive wie die Disulfidbrücke in der Domäne III, für die eine Bedeutung für die Faltung und Stabilität der Domäne III postuliert wurde, von besonderem Interesse. Um weitere funktionsrelevante konservierte Regionen in Domäne III aufzudecken, welche für die Lokalisierung und Funktion des gH wichtig sein könnten, wurden zunächst Sequenzvergleiche zwischen EBV und PrV gH unter Berücksichtigung der vorhandenen gH-Kristallstrukturen durchgeführt. Hierbei wurden komplexe Interaktionsnetzwerke über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen konservierten und benachbarten nicht-konservierten Aminosäuren vorhergesagt. Diese wurden im EBV und PrV gH mutiert und die gH-Proteine anschließend auf ihre Oberflächenexpression und Fusionsfunktion untersucht. Zusätzlich wurden PrV Rekombinanten mit entsprechenden gH-Mutationen hergestellt und charakterisiert.
  • Glycoproteins gB and gH-gL are conserved in all herpesviruses and required for virus entry as well as efficient direct cell-to-cell spread. However, PrV is able to spread to a very limited extent directly from cell to cell even in the absence of gL allowing reversion analysis by serial passages of gL-deleted PrV in cell culture. After a passage experiment revertant PrV-ΔgLPassB4.1 could be isolated. In the present study the molecular basis of the gL-independent infection of PrV-ΔgLPassB4.1 was analyzed. Thereby mutations in the glycoproteins gB, gH and gD were identified and with the help of transient transfection-fusion assays their effect on protein function was analyzed. Resolution of the crystal structures opened up the possibility for a better understanding of the function of gH-gL by site-directed mutagenesis. Surprisingly, the vaccine strain PrV-Bartha carried a substitution of an otherwise highly conserved proline by a serine. For the proline it was postulated that it is required for the formation of a disulfide bond, which is conserved in all herpesviruses. To test the effect of the substitution and the function of the disulfide bond, PrV gH-mutants were generated which express either proline or serine at position 438, or serine instead of cysteine at position 404 to inhibit disulfide bond formation. They were tested in transient transfection-fusion assays as well as in infection. Although gH-proteins of herpesviruses exhibit only modest amino acid homology, the crystal structures are surprisingly similar. Hence existing structural motives like the highly conserved disulfide bond in domain III, which is thought to be important for folding and stability of domain III, are of particular interest. To reveal additional important regions in domain III, which could be important for the localization and function of gH, sequence comparisons taking account of the available gH-crystal structures were performed between EBV and PrV gH. As a result, complex amino acid networks via hydrogen bonds between conserved and adjacent nonconserved amino acids were predicted. These amino acids were mutated in EBV and PrV gH and the gH-proteins were subsequently analyzed for surface expression and fusion function. In addition, PrV-recombinants expressing mutated gH were generated and characterized.

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Metadaten
Author: Christina Schröter
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002670-8
Title Additional (English):Molecular mechanism of herpesviral membrane fusion - Effect of mutations in the Pseudorabies Virus glycoproteins B, H and D on the fusion activity
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/11/29
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/10/26
Release Date:2016/11/29
Tag:Virus-Eintritt
membrane fusion, pseudorabies virus, virus entry
GND Keyword:Glykoprotein B, Glykoprotein D, Glykoprotein H, Herpesviren, Herpesvirus suis, Membranfusion
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES