Open Access

Maike Engelhardt

• Phospholipide wie Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin sind essenzielle Bestandteile aller biologischen Membranen und für deren Integrität und Funktion unerlässlich. Sind Inositol und Cholin (IC) im Medium vorhanden, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae in der Lage, diese aufzunehmen und zu verarbeiten. Unter Mangelbedingungen können diese Stoffe von der Zelle selbst synthetisiert werden. Daher ist es sinnvoll, die Phospholipid¬biosynthese-Gene differenziell zu exprimieren, was auf der Ebene der Transkriptions¬initiation geschieht. Bei IC-Mangel werden die Gene (z. B. das Inositol-3-Phosphat Synthase Gen INO1) durch Bindung des heterodimeren Aktivatorkomplexes Ino2/Ino4 an das Promotorelement ICRE („inositol/ choline responsive element“) aktiviert, um die Biosynthese zu gewährleisten. Sowohl Ino2 als auch Ino4 sind für die ICRE-Bindung nötig, während die transkriptionale Aktivierung nur durch Ino2 mit Hilfe zweier Transkriptionsaktivierungsdomänen TAD1 und TAD2 vermittelt wird. Ist dagegen ausreichend IC vorhanden, werden die Gene reprimiert, indem der Repressor Opi1 an den Aktivator Ino2 bindet, sodass es zu einer Konformationsänderung kommt und eine Dimerisierung mit Ino4 nicht mehr möglich ist. Um eine erfolgreiche Transkriptionsinitiation zu gewährleisten, bilden neben der RNA-Polymerase II eine Reihe genereller Transkriptionsfaktoren (A, B, D, E, F und H) sowie der Mediatorkomplex im Promotorbereich der Zielgene den sog. Präinitiationskomplex (PIC). Die von diesen basalen Faktoren gewährleistete geringe Grundexpression kann von Aktivatorproteinen, die an positiv-regulatorische Elemente („upstream activation site“, UAS) binden, deutlich verstärkt werden. Hierzu nutzen Aktivatorproteine verschiedene Mechanismen, zu denen die Auflockerung der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationskomplexe wie SAGA oder Chromatinremodellierungskomplexe wie SWI/SNF, die bessere Bindung der Transkriptionsfaktoren am Basalpromotorbereich oder die Beschleunigung des Übergangs vom geschlossenen zum offenen PIC gehören. Im Verlauf dieser Arbeit konnten zahlreiche Interaktionen zwischen dem Aktivator Ino2 und Faktoren der Transkriptionsmaschinerie nachgewiesen werden, die vermutlich die Häufigkeit der Trans¬kriptions-initiation beeinflussen. Einige der Untereinheiten des Transkriptionsfaktors TFIID interagie¬ren mit Ino2. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung der Interaktion der Ino2-TAD1 mit Taf1 und Taf12. Der Austausch der Aminosäuren Asparaginsäure-20 und Phenyl¬alanin-21 in Ino2 führte zu einem Interaktionsausfall mit beiden Tafs. In Taf1 konnten zwei basisch-hydro¬phobe Aminosäure-Bereiche (K206 Y207 und L208 L209 K210) innerhalb der minimalen Aktivator¬binde¬domäne 2 (ABD2) identifiziert werden, die kritisch für den Kontakt zum Aktivator sind. Es konnte ferner gezeigt werden, dass basische und hydrophobe Aminosäuren in Kombination für die Bindung an den Aktivator verantwortlich sind und dass der Austausch gegen Alanin (KY-AA) zu einem Abfall der Expression des INO1-Gens auf 44% führt. Darüber hinaus konnte der Bromo¬domänen¬faktor Bdf1 als Interaktionspartner von Ino2 identifiziert werden. Bdf1 vervollständigt Hefe-Taf1, während Säuger-Taf1 selbst Bromodomänen zur Erkennung von Histonacetylierungen beinhaltet. Innerhalb der Taf12-Minimaldomäne sind die Aminosäuren K150 L151 R175 und L176 wesentlich für die Bindung an Ino2. Eine Teildeletion von Taf12, die unter anderem den Verlust dieser Aminosäuren zur Folge hat, führt zu einer auf 76% reduzierten INO1-Expression. Ein weiterer Transkriptions¬faktor, der von Ino2 kontaktiert wird, ist TFIIA mit seinen Untereinheiten Toa1 und Toa2. Die Proteine kontaktieren beide TADs des Aktivators, allerdings konnten innerhalb der minimalen Interaktionsdomänen der Toa-Proteine keine für diese Interaktion verantwortliche Aminosäuren identifiziert werden. Veränderungen der Toa1-Sequenz hatten keinen phänotypischen Einfluss auf die Phospholipidbiosynthese, allerdings führten einige Veränderungen (RKRK-Motiv im AS-Bereich 253-259) zu letalen Folgen für das Wachstum der Zellen, weil die Bildung des TFIIA-TBP-TATA-Komplexes beeinträchtigt ist. Wahrscheinlich hat die Interaktion zwischen Ino2 und TFIIA eine verstärkende Wirkung auf die Transkriptionsinitiation der Phospholipidbiosynthese-Gene, indem die Interaktion zwischen TFIIA und TFIID stabilisiert wird und TFIIA die interaktive Oberfläche am Promotor für Interaktionen mit anderen Proteinen vergrößert. Die Verschiebung der Nucleosomen in Promotorbereichen durch Chromatinremodellierungs¬kompexe wie SWI/SNF ist ein weiterer Mechanismus der Transkriptionsaktivierung. In früheren Arbeiten wurde bereits die Interaktion zwischen Ino2, Aro80 bzw. Gal4 und der SWI/SNF ATPase-Untereinheit Swi2 beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit konnte eine minimale Interaktionsdomäne im AS-Bereich 238-307 kartiert werden. Essenzielle Aminosäuren für die Bindung an Ino2 und andere Aktivatoren konnten nicht identifiziert werden. Sug1 und Sug2 sind ATPasen der regulatorischen 19S-Untereinheit des 26S Proteasoms. Neben der Degradation fehlgefalteter polyubiquitinierter Proteine haben sie auch eine nicht-proteolytische Bedeutung für die Transkriptionsinitiation. Bekannt ist, dass proteasomale ATPasen an aktiven Promotoren zu finden sind und mit Aktivator¬proteinen (z. B. Gal4) interagieren können. Die vorlie¬gende Arbeit zeigt, dass auch Ino2 von Sug1 und Sug2 kontaktiert wird. Möglicherweise dienen sie am INO1-Promotor als Stabilisatoren und Vermittler zwischen Ino2 und der Transkriptionsmaschi¬nerie und erleichtern den Übergang des Präinitiationskomplexes in den Elongationskomplex. Unter reprimierenden Bedingungen bindet Opi1 an Ino2 und rekrutiert die Corepressorkomplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die ihrerseits Histondeacetylasen in Promotornähe bringen und die Transkrip¬tion durch lokale Chromatinverfestigung reprimieren. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass die Corepressoren auch mit Ino2 und weiteren Aktivatoren (Hac1 und Pho4) interagieren und dass sie in Abhängigkeit von Ino2, nicht aber von Opi1, am INO1-Promotor vorliegen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Ino2 und Sin3 bzw. Cyc8 charakterisiert. Sin3 und Cyc8 kontaktieren einen Bereich des Aktivators, der die TAD2 und die RID (Repressorinteraktionsdomäne) enthält. Es war bekannt, dass die Aminosäuren Phenylalanin-130, Leucin-131 und Asparaginsäure-132 essenziell für die Interaktion mit Opi1 sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass deren Austausch gegen Alanin auch einen Interaktionsverlust mit Cyc8 und Sin3 bewirkt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese FLD-AAA-Mutation zu einer praktisch konstitutiven Expression des INO1-Gens führt, allerdings auf niedrigerem Niveau als im Fall dereprimierter Zellen mit einem Wildtyp Ino2. In Hac1 und Pho4 konnten Aminosäuren mit vergleichbarer Bedeutung für die Corepressorbindung nicht identifiziert werden. Offenbar können die Corepressoren je nach physiologischer Situation in der Zelle positiv oder negativ auf die Transkriptionsinitiation wirken.
• Phospholipids such as phosphatidylinositol and phosphatidylcholine are essential components of all biological membranes and are essential for their integrity and function. If inositol and choline (IC) are present in the medium, the yeast Saccharomyces cerevisiae is able to import them for subsequent biochemical use. In the absence of precursors, these substances can be synthesized by the cell. Thus, it is reasonable to differentially express phospholipid biosynthetic genes at the level of transcriptional initiation. Under conditions of IC limitation, genes (such as the inositol-3-phosphate synthase gene INO1) are activated by binding of the heterodimeric activator complex Ino2/Ino4 to the promoter element ICRE (“inositol/choline responsive element“) to ensure biosynthesis. Ino2 as well as Ino4 are required for ICRE binding while transcriptional activation is mediated exclusively by Ino2 via two transcriptional activation domains, TAD1 and TAD2. In the presence of high concentrations of IC, the genes are repressed by repressor Opi1 which binds to activator Ino2, triggering a conformational change so that dimerization with Ino4 is no longer possible. To ensure transcriptional initiation, RNA polymerase II together with a number of general transcription factors (A, B, D, E, F and H) as well as the mediator complex forms the preinitiation complex (PIC) in the promoter region of the target genes. These basal factors ensure a low level of gene expression which can be increased substantially by binding of activator proteins to “upstream activation sites” (UAS). To achieve this, activators can use various mechanisms, including structural changes of chromatin by histone modification complexes such as SAGA or chromatin remodelling by complexes such as SWI/SNF, the improved binding of transcription factors at the basal promoter or acceleration of the transition from closed to open PIC. In this work, numerous interactions between the activator Ino2 and factors of the transcriptional machinery have been demonstrated which presumably influence the frequency of transcriptional initiation. Some of the subunits of the transcription factor TFIID interact with Ino2. This work focused on the characterization of the interaction of Ino2-TAD1 with Taf1 and Taf12. The exchange of the amino acids aspartic acid-20 and phenylalanine-21 in Ino2 abolished interaction with both Tafs. In Taf1, two basic-hydrophobic amino acid regions (K206 Y207 and L208 L209 K210) within its minimal activator binding domain 2 (ABD2) were identified which are critical for activator contact. In addition, it could be shown that basic and hydrophobic amino acids in combination are responsible for binding to the activator and that the exchange to alanine (KY-AA) decreased expression of the INO1 gene to 44%. Furthermore, the bromodomain factor Bdf1 could be identified as an interaction partner of Ino2. Bdf1 completes yeast Taf1, while mammalian Taf1 itself contains bromodomains for the detection of histone acetylations. Within the Taf12 minimal domain, amino acids K150 L151 R175 and L176 are important for binding to Ino2. A partial deletion of Taf12 resulting in the loss of these amino acids leads to a reduction of INO1 expression to 76%. Another transcription factor contacted by Ino2 is TFIIA with its subunits Toa1 and Toa2. The proteins contact both TADs of the activator, but no individual amino acids important for this interaction could be identified within minimal interaction domains of the Toa proteins. Mutations of the Toa1 sequence did not have a phenotypic influence on phospholipid biosynthesis, but some alterations (RKRK-motif at AA 253-259) had lethal consequences for cell growth because formation of the TFIIA-TBP-TATA complex was affected. Presumably, interaction between Ino2 and TFIIA has an enhancing effect on transcriptional initiation of the phospholipid biosynthetic genes by stabilizing the interaction between TFIIA and TFIID and the increase of the interactive surface area at the promoter for interactions with other proteins. The displacement of nucleosomes in promoter regions by chromatin remodeling complexes such as SWI/SNF is another mechanism of transcriptional regulation. Previous work has already described the interaction between Ino2, Aro80 or Gal4 and the SWI/SNF ATPase subunit Swi2. In this work, a minimal interaction domain (aa 238-307) could be mapped. Amino acids essential for binding to Ino2 and other activators could not be identified. Sug1 and Sug2 are ATPases of the regulatory 19S subunit of the 26S proteasome. In addition to the degradation of misfolded polyubiquitinated proteins, they also have a non-proteolytic role for transcription initiation. It is known that proteasomal ATPases are found at active promoters and that they can interact with activator proteins (e. g. Gal4). The present work shows that Ino2 is also contacted by Sug1 and Sug2. Presumably, they serve as a stabilizer and mediator between Ino2 and the transcription machinery at the INO1 promoter and facilitate the transition from the preinitiation complex to the elongation complex. Under repressing conditions, Opi1 binds to Ino2 and recruits the corepressor complexes Sin3 and Cyc8/Tup1, which in turn bring histone deacetylases near the promoter and repress transcription by local chromatin condensation. Previous work had shown that these corepressors interact with Ino2 and other activators (Hac1 and Pho4) and that they are present at the INO1 promoter in dependence of Ino2 but not of Opi1. In this thesis, the interaction between Ino2 and Sin3 or Cyc8 was characterized. Sin3 and Cyc8 contact a region of the activator containing the TAD2 and the RID (repressor interaction domain). It is known that amino acids phenylalanine-130, leucine-131 and aspartic acid-132 are essential for the interaction with Opi1. In this work it was shown that their exchange to alanine also causes a loss of interaction with Cyc8 and Sin3. Furthermore, it could be shown that an FLD-AAA mutation leads to almost constitutive expression of the INO1 gene, but at a level below that of derepressed cells with a wild-type Ino2. In Hac1 and Pho4, amino acids comparably important for interaction with corepressors could not be identified. Apparently, depending on the physiological situation in the cell, corepressors can have a positive or a negative effect on transcription initiation.