Open Access

Jana Marielle Modenbach

• Die akute Pankreatitis ist durch eine vorzeitige Aktivierung von Verdauungsenzymen noch innerhalb der Azinuszellen gekennzeichnet. Die lysosomale Hydrolase Cathepsin B (CTSB) spielt hierbei eine entscheidende Rolle, indem sie Trypsinogen zu Trypsin aktiviert. Für die Trypsinogenaktivierung durch CTSB ist eine Co-Lokalisierung beider Enzyme innerhalb desselben subzellulären Kompartiments erforderlich. Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation der CTSB-Aktivität durch den Cysteinprotease-Inhibitor Cystatin C im Verlauf der akuten und chronischen Pankreatitis näher zu untersuchen. Subzelluläre Fraktionierungsexperimente zeigten eine deutliche Lokalisation von Cystatin C und aktiven Cathepsin B im sekretorischen Kompartiment muriner Azinuszellen. Immunofluoreszenzfärbungen zeigten ebenfalls, dass Cystatin C zusammen mit der pankreatischen Amylase im sekretorischen Kompartiment von Azinuszellen lokalisiert ist. Auch in humanen Probenmaterial konnten wir zeigen, dass Cystatin C im sekretorischen Kompartiment lokalisiert ist und auch sekretiert wird. Experimente mit rekombinanten Proteinen zeigten eine deutliche pH-abhängige inhibitorische Wirkung von Cystatin C auf Cathepsin B. Unter sauren pH Bedingungen dimerisiert Cystatin C und ist somit nicht mehr in der Lage die Aktivität von CTSB zu inhibieren. Weiterhin konnten wir zeigen, dass aktives Trypsin Cystatin C prozessiert. Bei dieser Spaltung entsteht ein Cystatin C-Fragment, welches nicht mehr in der Lage ist, CTSB zu inhibieren, sondern vielmehr die auto-inhibitorische Kapazität von Cathepsin B unterbindet und somit die Aktivität stabilisiert. Neben Cystatin C wird in Azinuszellen auch Cystatin B exprimiert, ein weiterer Inhibitor der Cystein-Proteasen. Im Gegensatz zu Cystatin C ist Cystatin B exklusiv im cytosolischen Kompartiment der Azinuszelle lokalisiert. Dies ist wahrscheinlich ein Schutzmechanismus, welcher die Zelle vor einer cytosolischen Cathepsin-Aktivität schützen soll. Die genetische Deletion von Cystatin C im Mausmodell der akuten Pankreatitis führte zu einer erhöhten Aktivität sekretorischer Proteasen in Azinuszellen, sowie im Gesamthomogenat und in subzellulären Fraktionen. Dementsprechend zeigte sich auch ein deutlich erhöhter Schweregrad in der akuten und chronischen Pankreatitis. Unsere Experimente lassen vermuten, dass die Aktivität von Cathepsin B unter physiologischen Bedingungen durch Cystatin C unterbunden wird, um so eine verfrühte Aktivierung des Trypsinogens zu verhindern. Im Verlauf der Pankreatitis wird dieser protektive Mechanismus jedoch überwunden. Die Aktivität von Cathepsin B steigt deutlich in der schweren Zymogengranula-Fraktion an, trotz der Präsenz von Cystatin C. Zusammenfassend lassen unsere Ergebnisse vermuten, dass prozessiertes (aktives) Cathepsin B selbst unter physiologischen Bedingungen im sekretorischen Kompartiment von Azinuszellen bereits vorhanden ist. Seine Aktivität wird dort durch Cystatin C inhibiert, wodurch eine vorzeitige, durch CTSB induzierte Trypsinogenaktivierung verhindert wird. Die Ansäuerung der sekretorischen Vesikel, wie bei der Pankreatitis, verringert die CTSB-Hemmung durch Cystatin C, während es gleichzeitig zu einer Cystatin C-Degradation durch Trypsin kommt. Dies ermöglicht eine verlängerte und pH-unempfindliche Protease-Aktivierung über CTSB in der Anfangsphase der Pankreatitis. Cystatin C spielt somit eine wesentliche Rolle für die Regulation der CTSB-Aktivität im sekretorischen Kompartiment von Azinuszellen und stellt damit einen entscheidenden pathophysiologisch relevanten Mechanismus für die akute und chronische Pankreatitis dar.
• Acute pancreatitis is characterized by premature activation of digestive enzymes still within the acinar cells. The lysosomal hydrolase cathepsin B (CTSB) plays a crucial role in this process by activating trypsinogen to trypsin. Co-localization of both enzymes within the same subcellular compartment is required for trypsinogen activation by CTSB. The aim of this work was to further investigate the regulation of CTSB activity by the cysteine protease inhibitor cystatin C during acute and chronic pancreatitis. Subcellular fractionation experiments demonstrated a distinct localization of cystatin C and active cathepsin B in the secretory compartment of murine acinar cells. Immunofluorescence staining also showed that cystatin C is localized together with pancreatic amylase in the secretory compartment of acinar cells. In human sample material, we also showed that cystatin C is localized in the secretory compartment and is also secreted. Experiments with recombinant proteins revealed a clear pH-dependent inhibitory effect of cystatin C on cathepsin B. Under acidic pH conditions, cystatin C dimerizes and is thus no longer able to inhibit the activity of CTSB. Furthermore, we could show that active trypsin degrades cystatin C. This cleavage produces a cystatin C fragment that is no longer able to inhibit CTSB, but rather inhibits the auto-inhibitory capacity of cathepsin B and thus stabilizes its activity. In addition to cystatin C, cystatin B, another inhibitor of cysteine proteases, is also expressed in acinar cells. In contrast to cystatin C, cystatin B is exclusively localized in the cytosolic compartment of the acinar cell. This is probably a protective mechanism intended to protect the cell from cytosolic cathepsin activity. Genetic deletion of cystatin C in the mouse model of acute pancreatitis resulted in increased activity of secretory proteases in acinar cells, as well as in total homogenate and subcellular fractions. Accordingly, there was also a marked increase in severity in acute and chronic pancreatitis. Our experiments suggest that cathepsin B activity is prevented by cystatin C under physiological conditions, thus preventing premature activation of trypsinogen. However, during pancreatitis this protective mechanism is overcome. Cathepsin B activity increases significantly in the heavy zymogen granule fraction, despite the presence of cystatin C. In conclusion, our results suggest that processed (active) cathepsin B is already present in the secretory compartment of acinar cells even under physiological conditions. Its activity there is inhibited by cystatin C, preventing premature trypsinogen activation induced by CTSB. Acidification of secretory vesicles, as during pancreatitis, reduces CTSB inhibition by cystatin C, while simultaneously causing cystatin C degradation by trypsin. This allows prolonged and pH-insensitive protease activation via CTSB in the initial phase of pancreatitis. Cystatin C thus plays an essential role in the regulation of CTSB activity in the secretory compartment of acinar cells and thus represents a crucial pathophysiologically relevant mechanism for acute and chronic pancreatitis.