Open Access

Merete Hartmann

• Thioredoxine (Trxs) bilden eine Familie ubiquitärer Oxidoreduktasen, welche durch posttranslationale Redox-Modifikationen von Cysteinyl-Thiolgruppen sowie die Regulation der intrazellulären Wasserstoffperoxidgehaltes die zelluläre Redoxantwort steuern. Es ist bekannt, dass Thioredoxine, Glutaredoxine (Grxs) und Peroxiredoxine (Prxs) wesentliche Signalwege von Inflammation, Proliferation und Apoptose beeinflussen und somit in vielen Pathologien, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen wie dem allergischen Asthma, eine entscheidende Rolle spielen. Derzeit sind vorwiegend die intrazellulären Funktionen der Proteine der Trx-Familie in Gesundheit und Krankheit umfassend untersucht, doch die extrazellulären Funktionen bei der Redox-Signalübertragung bleiben bis zum heutigen Tage weitestgehend im Dunkeln. In dieser Arbeit haben wir uns daher zum Ziel gesetzt, Verteilung und Funktion von Proteinen der Trx-Familie in der Regulation der Immunantwort zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf dem extrazellulären Vorkommen und den damit verbundenen Eigenschaften liegt. Allergische Atemwegsentzündungen sind durch bronchiale Obstruktion und chronischen Umbau sowie Hyperreagibilität der Atemwege gekennzeichnet. Die Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies in der bronchialen Flüssigkeit der Lunge und die sich daraus ergebenden Veränderungen des Redoxzustands in den bronchialen Epithelzellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Asthmaforschung gerückt. Mehrere Studien beschrieben eine positive Wirkung von Trx1 und Grx1 in Atemwegsinfektionen, so würde eine Th2-typische Immunmodulation reduziert und verringere in der Folge den Umbau der Atemwegsstruktur – eine zentrale Pathologie des Asthmas. In dieser Studie untersuchten wir die Expressionsniveaus von Proteinen der Trx-Familie in Lungengewebe und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit in einem Mausmodell der Ovalbumin (OVA) induzierten allergischen Atemwegsentzündung. Wir konnten eine Zunahme von Grx2 und Prx4 in intrazellulären Proben aus der Mäuselunge nach einsetzen der induzierten Atemwegsinfektion zeigen. Ausschließlich unter OVA-induzierter Inflammation wurde in diesen Proben eine zweite Isoform von Grx2, zytosolisches Grx2c, nachgewiesen. Die Behandlung von Mäusen mit intraperitoneal appliziertem, rekombinantem Grx2 parallel zur Induktion der Entzündung mit OVA, hatte eine entzündungshemmende Wirkung, die zu einer Verringerung des asthmatischen Phänotyps in der Immunhistochemie und einer signifikanten Reduktion der Gesamtzahl der Entzündungszellen, besonders der eosinophilen Granulozyten führte. Die Verabreichung der rekombinanten Grx2C40S-Mutante, der die Fähigkeit zur Katalyse des Dithiol-Reaktionsmechanismus fehlt, hatte nicht die gleiche entzündungshemmende Wirkung. Eine zusätzlich durchgeführte His-Tag-Färbung zeigte eine Aufnahme von rekombinantem Grx2 in die Epithelzellen und Makrophagen der entzündeten Lunge. Die Färbung von Lungenabschnitten für HIF1- und Pro-Caspase3 nahm nach Beginn der allergischen Atemwegsentzündung zu und ging bei den mit dem wildtyp Grx2 behandelten Mäusen deutlich zurück. In den extrazellulären Fraktionen war die Konzentration von Trx1, Grx1, Prx2 und Prx4 unter Entzündungsbedingungen erhöht, zudem konnte Prx4 in dieser Studie erstmals nur in der Entzündung, nicht aber bei gesunden Mäusen nachgewiesen werden. In-vitro-Experimente, bei denen Makrophagen aus Balb/c-Mäusen stimuliert wurden, sollten Aufschluss über die Funktionen von Trxs und Grxs in der Immunantwort geben. Grx2 und Trx1 wurden als potenzielle Stimulatoren von Makrophagen identifiziert, die die Sekretion von RANTES, IL-6, IL-10 und TNF-α induzieren, während die Zytokinspiegel von IL-4 und INF-γ nicht verändert wurden. Bei kombinierter Verabreichung von Redoxinen mit LPS/IFN-γ, die einen Entzündungszustand nachahmt, wurde gezeigt, dass Trx1 die Zytokinspiegel von TNF-α und INF-γ im Vergleich zu LPS/IFN-γ allein senkt. Die Behandlung mit Trx1/LPS/IFN-γ induzierte die Produktion von IL-6 und RANTES auf ein Niveau vergleichbar mit der alleinigen Stimulation durch LPS/IFN-γ. Diese Arbeit beleuchtet Proteinveränderungen von Thioredoxinen, Glutaredoxinen und Peroxiredoxinen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen mit besonderem Schwerpunkt auf der extrazellulären Verteilung und Funktion der Proteine. Wir zeigen, dass die Veränderungen der Proteinspiegel selektiv reguliert werden und zu einem fein abgestimmten Netzwerk von Partnern in der Redox-Signalgebung beitragen und somit Potenzial für mögliche Therapieansätze bieten.
• Thioredoxin (Trx) family proteins are omnipresent oxidoreductases with major functions in cellular redox signalling, catalysing post-translational redox modifications of cysteinyl thiol groups and regulating intracellular levels of the second messenger molecule hydrogen peroxide. Thioredoxins, glutaredoxins (Grxs) and peroxiredoxins (Prxs) are known to influence essential cellular pathways in inflammation, proliferation, and apoptosis which are determining factors in inflammatory diseases, such as asthma. To date primarily intracellular functions of Trx family proteins in health and disease have been described, however extracellular functions in redox signalling still need further investigation. Therefore, we aimed at examining distribution and functions of Trxs, Grxs and Prxs in immune response with a focus on extracellular distribution. Allergic airway inflammation is characterized by chronic airway remodelling, bronchial obstruction and airway hyper-responsiveness. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in the epithelial lining fluid of the lung and the subsequent alterations of the redox state in the bronchial epithelial cells has been acknowledged in recent years. Several studies have suggested a beneficial effect for Trx1 as well as Grx1 by preventing a type-2 helper T-cell (Th2)-prone immune modulation followed by reduced airway remodelling. In this study, we investigated the expression levels of Trx family proteins in lung tissue and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid in a mouse model of ovalbumin (OVA)-induced allergic airway inflammation. We discovered an increase of Grx2 and Prx4 in intracellular samples from mouse lungs upon airway inflammation. Exclusively under OVA-induced airway inflammation the presence of second isoform of Grx2, cytosolic Grx2c, was detected. Intraperitoneal injection of mice with recombinant Grx2WT during OVA-challenge had an anti-inflammatory effect, resulting in decreased asthmatic phenotype and significantly reduced total BAL cell count as well as eosinophilia. Administration of recombinant Grx2C40S mutant, lacking the capacity to catalyse the dithiol switch, did not display the same anti-inflammatory effect. An additional His-tag staining displayed an uptake of recombinant Grx2 in the epithelial cells and macrophages of the inflamed lung. Staining of lung sections for HIF1- and pro-caspase3 increased after onset of allergic airway inflammation and decreased in mice treated with Grx2. The levels of Trx1, Grx1, Prx2 and Prx4 were increased in the extracellular fractions upon lung inflammation and Prx4 could only be detected in allergic airway inflammation, not in healthy mice. In vitro experiments stimulating macrophages elicited form Balb/c mice attempted to shed a light on functions of Trxs and Grxs in immune response. Grx2 and Trx1 have been identified as potential activators of macrophages, inducing secretion of RANTES, IL-6, IL-10, and TNF-α, whereas cytokine levels of IL-4 and INF-γ have not been altered. Upon combined administration of redoxins with LPS/IFN-γ, mimicking acute inflammation, Trx1 reduced cytokine levels of TNF-α and INF-γ compared to LPS/IFN-γ alone. Treatment with Trx1/LPS/IFN-γ induced IL-6 and RANTES production to a level seen after LPS/IFN-γ stimulation only. This thesis illuminates protein changes of Trxs, Grxs and Prxs in a murine model for allergic airway inflammation, with emphasis on extracellular distribution and functions. We indicate that alterations in protein levels are selectively regulated and contribute to a fine-tuned network of partners in redox signalling, providing potential for possible therapeutic approaches.