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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002870-7

A thiol-disulphide switch in the regulation of cytoskeletal dynamics

  • Numerous signalling pathways orchestrate the development, the functions, and the survival of cells, mostly in response to external stimuli. An overwhelming amount of data supports the concept of specific, spatio-temporal redox signalling pathways that affect the redox state of protein cysteinyl side chains and thus the biological function of these proteins. Glutaredoxins (Grxs) and thioredoxins (Trxs) catalyse reversible thiol-disulphide exchange reactions. The cytosolic Grx2 isoform Grx2c is essential for brain development and axonal outgrowth. A reversible dithiol-disulphide switch of CRMP2 has been identified as one of the major targets regulated by Grx2c. This CRMP2 redox switch is toggled in neuronal differentiation. Reduction of CRMP2 thiols induces profound conformational changes, modifying interactions and downstream elements of this redox switch. In [article I] and [manuscript V], we identified the Cys504 of CRMP2 to be the redox regulated residue. We used various in vitro assays with recombinant protein and molecular dynamics simulations to characterise the conformational change. The changes involve the solvent accessible surface area of at least one known phosphorylation site at the C-terminus of the protein. In [article III], we analysed the function of Grx2 and Trx1 in a model for perinatal asphyxia. Trx family proteins exhibit a very complex, cell-type and tissue specific expression pattern following hypoxia/ischemia and reoxygenation, especially Trx1 and Grx2. The results imply the clinical relevance for both proteins in perinatal asphyxia as well as many other neurological disorders. In agreement with the results presented in [articleI], Grx2 may be required for the re-establishment of neuronal integrity and connectivity. Cell shape, all forms of intracellular transport, and cell movement depend on the cytoskeleton, particularly on the fine tuned complex regulation of the dynamic re-arrangement of actin filaments and microtubules. In [article IV], we discuss the redox regulation of this dynamic cytoskeletal remodelling. Taking recent discoveries into account, we focus on redox signalling mechanisms, e.g. reversible thiol and methionyl switches. These switches are specifically controlled by enzymes such as Trx1 and Grx2c, for instance, and not the result of random modification by unspecific oxidants. Methionyl sulphoxidation of actin can be reversed by methionyl sulphoxide reductase (MsrA), promoting actin polymerisation. Human cells express two different Msr enzymes (MsrA and MsrB), that can reduce S- and R-methionyl sulphoxide, respectively. In the gram-positive Streptococcus pneumoniae, on the other hand, both Msr genes and thus enzymes were fused during evolution. In [article II], we characterised the surface-exposed thioredoxin family lipoproteins Etrx1 and 2 and regulators of this Msr (SpMsrAB). A loss of function of both Etrx proteins or SpMsrAB dramatically reduced pneumococcal virulence, enhanced the bacterial uptake by macrophages, and accelerated pneumococcal killing by H2O2 or free methionine sulphoxide. Identification and characterisation of components of this redox regulated system may contribute to the design of new antimicrobials. In [manuscript VI], we investigated the effects of Grx2c expression on cell morphology, migration, and invasion behaviour of cancer cells. Grx2c expressing cancer cells developed dramatic changes in phenotype, including alterations in cytoskeletal dynamics and significantly increased motility and invasiveness. We used quantitative proteomics and phopshoproteomic approaches to characterise the underlying mechanisms. Proteins and pathways regulating cytoskeletal dynamics, cell adhesion, and receptor-mediated signal transduction were detected to be specifically altered. We started a clinical pilot study with patients suffering from clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). Grx2c was expressed with significantly higher frequency in ccRCC compared to healthy kidney tissue, associated with a strong trend for locally more advanced tumour stages and a clear tendency for a decreased cancer-specific survival, compared to patients without detectable Grx2c. These results were supported by data from "The Cancer Genome Atlas". In synopsis, the results presented and discussed in these articles and manuscripts, support the concept of specific redox signalling in different models and model organisms. They also demonstrate the importance of the specific redox control of signalling pathways that, in the case of errors or misinterpretations, contribute to pathophysiological alterations. The regulation of the CRMP2 redox switch by Grx2c, for instance, is physiologically essential for brain development, but might lead to cancer progression, if "switched on" in adult tissue. Identification of further interaction partners as well as the development of compounds modulating this redox switch and CRMP2s conformations, will be part of our future research.
  • Zahllose Signalwege bestimmen die Entwicklung, die Funktion und das Überleben von Zellen. Eine überwältigende Menge an Daten stützt das Konzept spezifischer Redox-Signalwege, die den Redoxstatus von cysteinyl Seitenketten von Proteinen beeinflussen und somit deren biologische Funktion ändern. Glutaredoxine (Grxe) und Thioredoxine (Trxe) katalysieren reversible Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen. Die zytosolische Grx2 Isoform Grx2c ist essentiell für die Gehirnentwicklung und das Auswachsen von Axonen. Ein reversibler Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2, welcher in der neuronalen Differenzierung reguliert wird, konnte als wichtiges Ziel von Grx2c identifiziert werden. Die Reduktion der Thiole in CRMP2 führt zu einer umfassenden Konformationsänderung, welche die Interaktionen und nachgeschalteten Elemente des Redox-Schalters modifiziert. In [Artikel I] und [Manuskript V] haben wir CRMP2‘s Cys504 als redoxregulierten Rest identifiziert. Wir nutzten verschiedene in vitro Analysen mit rekombinantem Protein und Molekulardynamische Simulationen um die Konformationsänderung zu charakterisieren. Die Veränderungen betreffen auch die Lösemittel-zugängliche Oberfläche von mindestens einer bekannten Phosphorylierungsstelle am C-Terminus des Proteins. In [Artikel III] analysierten wir die Funktion von Grx2 und Trx1 in einem Modell für perinatale Asphyxie. Proteine der Trx-Familie zeigen ein sehr komplexes, Zelltyp und Gewebe spezifisches Expressionsmuster nach Hypoxie/Ischämie und Reoxygenierung, vor allem Grx2 und Trx1. Die Ergebnisse lassen eine klinische Relevanz beider Proteine auch in vielen anderen neurologischen Erkrankungen vermuten. Grx2 ist vermutlich notwendig für die Wiederherstellung der neuronalen Integrität und Konnektivität, übereinstimmend mit den in [Artikel I] präsentierten Ergebnissen. Zellform, intrazellulärer Transport und Zellbewegung hängen vom Zytoskelett ab, vor allem von der genau abgestimmten und komplex regulierten Reorganisation von Aktinfilamenten und Mikrotubuli. Wir diskutieren die Redoxregulation der dynamischen Zytoskelett Umformung in [Artikel IV]. Der Fokus liegt auf Redox-Signalmechanismen, wie z.B. reversible Thiol und Methionin Schalter, welche durch Enzyme, z.B. Trx1 und Grx2, spezifisch reguliert werden und keine zufälligen Modifikationen durch unspezifische Oxidationsmittel sind. Methionylsulfoxide in Aktin können durch die Methionylsulfoxid Reduktase (Msr) reduziert werden, was die Aktinpolymerisation fördert. Humane Zellen exprimieren zwei verschieden Msr Enzyme (MsrA/MsrB) während bei Streptococcus pneumoniae beide Msr Gene und ebenso die Enzyme während der Evolution verschmolzen sind. In [Artikel II] charakterisieren wir die Oberflächen-exponierten Lipoproteine Etrx1 und 2 als Regulatoren dieser Msr (SpMsrAB). Ein Funktionsverlust beider Etrx Proteine oder von SpMsrAB reduzierte die Virulenz der Pneumokokken drastisch, erhöhte die Aufnahme durch Makrophagen und beschleunigte das Abtöten durch H2O2 oder freies Methioninsulfoxid. Die Identifikation und Charakterisierung von Komponenten dieses redoxregulierten Systems können zur Entwicklung neuer antimikrobieller Stoffe beitragen. Im [Manuskript VI] untersuchten wir die Effekte der Grx2c Expression in Krebszellen. Grx2c exprimierende Zellen entwickelten drastische Veränderungen des Phänotyps, inklusive Veränderungen der Zytoskelettdynamik und signifikant erhöhter Beweglichkeit und Invasivität. Mit Hilfe quantitativer Proteomics und Phosphoproteomics charakterisierten wir die zugrunde liegenden Mechanismen. Vor allem Proteine und Signalwege, welche die Zytoskelettdynamik, Zelladhäsion und Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion regulieren, waren verändert. In einer klinischen Pilotstudie mit Patienten, welche an klarzelligem Nierenzellkarzinom (ccRCC) erkrankt sind, fanden wir Grx2c Expression häufiger in ccRCC verglichen mit gesundem Nierengewebe. Es zeigte sich zudem ein Trend zu fortgeschrittenen Tumorstadien und eine klare Tendenz zu einer geringeren Krebs-spezifischen Überlebensrate in Patienten mit detektierbarem Grx2c verglichen zu denen ohne. Diese Ergebnisse werden von Daten aus „The Cancer Genome Atlas“ gestützt. Zusammenfassend unterstützen die Ergebnisse, welche in den Artikeln und Manuskripten dieser Arbeit präsentiert und diskutiert wurden, das Konzept der spezifischen Redox-Signalwege in verschiedenen Modellen und Modellorganismen. Sie demonstrieren wie wichtig die spezifische Redox-Kontrolle von Signalwegen ist, welche im Fall von Fehlern oder Missinterpretationen, zu pathologischen Veränderungen beitragen. Die Regulation des CRMP2 Redox-Schalters durch Grx2c ist essenziell für die Gehirnentwicklung, trägt aber möglicherweise zu Krebsentwicklung bei, wenn er im Gewebe eines Erwachsenen „eingeschaltet“ wird. Die Identifizierung weiterer Interaktionspartner sowie die Entwicklung von Stoffen die diesen Redox-Schalter und damit die Konformation von CRMP2 modulieren sind Bestandteil unserer zukünftigen Forschung.

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Metadaten
Author: Manuela Gellert
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002870-7
Title Additional (German):Ein Thiol-Disulfid-Schalter in der Regulation der Zytoskelettdynamik
Advisor:Prof. Dr. Christiane A. Helm, Dr. Christopher Horst Lillig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2017/09/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/08/28
Release Date:2017/09/07
Tag:Collapsin Response Mediator Protein 2, Glutaredoxin 2, Posttranslationale Modifikation, Proteinbiochemie, Signalwege
collapsin response mediator protein 2, glutaredoxin 2, posttranslational modification, protein biochemistry, signalling pathways
GND Keyword:Phosphorylierung, Redoxregulation, Thioredoxine, Zellmigration, Zytoskelett
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie