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Qingyun Tang

• S-adenosyl-L-methionine- (SAM) dependent methyltransferases (MTs) catalyse methylation of halide ions and the C, O, N, S, Se, and As atoms of biomolecules ranging from biopolymers to small molecules. They display different chemo-, regio- and stereoselectivity according to their specific functions. This thesis focuses on the engineering of O-methyltransferases (OMTs) and halide methyltransferases (HMTs) through rational design and directed evolution to study their structure-function relationship and to explore their catalytic promiscuity. The influence of substrate binding residues on the substrate scope and regioselectivity of a plant OMT against various phenolic substrates (Article I) and flavonoids (Article II) has been investigated. Article III describes the directed evolution of an HMT for the biocatalytic synthesis of diverse SAM analogues. With the evolved HMT, regioselective alkylation of phenolic compounds and flavonoids, as well as the SAM analogue regeneration, were achieved through an HMT-MT cascade reaction. Article I Specific residues expand the substrate scope and enhance the regioselectivity of a plant O-methyltransferase. It was reported in literature that an isoeugenol 4-OMT (IeOMT) can be engineered to a caffeic acid 3-OMT (CaOMT) by replacing three consecutive residues. In this article, we investigated the effect of these residues on substrate preference and regioselectivity of IeOMT. The triple mutant T133M/A134N/T135Q and the respective single mutants were constructed and tested against a series of phenolic compounds. The variant T133M had a universal effect to improve enzymatic activities against all tested substrates while the mutant A134N had enhanced regioselectivity. The triple mutant T133M/A134N/T135Q benefits from these two mutations, which not only expanded the substrate scope, but also enhanced the regioselectivity of IeOMT. On the basis of this work, regiospecific methylated phenolics can be produced in high purity by different IeOMT variants. Article II Influence of substrate binding residues on the substrate scope and regioselectivity of a plant O-methyltransferase against flavonoids Flavonoid OMTs (FOMTs), isoflavonoid OMTs (IOMTs) and phenylpropanoid OMTs (POMTs) display different substrate preferences. Sequence comparison showed that the substrate binding residues at positions 322 and 326 are different between these OMT groups and might be critical for the substrate discrimination. Residues at positions 322 and 326 in IeOMT (a POMT) were mutated to the commonly presented residues in FOMT and IOMT. The introduced mutants, in cooperation with the variant T133M, have improved or brought novel activities and regioselectivity against the tested flavonoids eriodictyol, naringenin, luteolin, quercetin, and also the isoflavonoid genistein compared to the wild-type IeOMT. On the basis of this work, methylated flavonoids that are rare in nature were produced in high purity. Article III Directed evolution of a halide methyltransferase enables biocatalytic synthesis of diverse SAM analogs Biocatalytic alkylations to obtain chemo‐, regio‐ and stereoselectively alkylated compounds can be achieved by MTs with the supply of SAM analogues. It was recently discovered that SAM can be directly synthesized from S adenosyl-L homocysteine (SAH) and methyl iodide, catalysed by an HMT. To explore the promiscuity of HMT in the synthesis of SAM analogues, we performed directed evolution of the Arabidopsis thaliana HMT based on a sensitive, colorimetric iodide assay. The identified variant V140T displayed activities against ethyl‐, propyl‐, and allyl iodides to produce the corresponding SAM analogues. With this HMT variant, regioselective ethylation of luteolin and allylation of 3,4‐dihydroxybenzaldehyde, as well as the SAM analogue regeneration, were achieved through this HMT-MT one-pot cascade reaction.
• S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) -abhängige Methyltransferasen (MTs) katalysieren die Methylierung von Halogenidionen und den C-, O-, N-, S-, Se- und As-Atomen von Biomolekülen, die von Biopolymeren bis zu kleinen Molekülen reichen. Sie zeigen je nach ihren spezifischen Funktionen unterschiedliche Chemo-, Regio- und Stereoselektivitäten. Diese Arbeit konzentriert sich auf das Engineering von O-Methyltransferasen (OMTs) und Halogenidmethyltransferasen (HMTs) durch rationales Design und gerichtete Evolution, um ihre Struktur-Funktions-Beziehung zu untersuchen und ihre katalytische Promiskuität zu untersuchen. Der Einfluss von Substratbindungsresten auf den Substratumfang und die Regioselektivität eines pflanzlichen OMT gegen verschiedene phenolische Substrate (Artikel I) und Flavonoide (Artikel II) wurde untersucht. Artikel III beschreibt die gerichtete Entwicklung eines HMT zur biokatalytischen Synthese verschiedener SAM-Analoga. Mit dem entwickelten HMT wurde eine regioselektive Alkylierung von Phenolverbindungen und Flavonoiden sowie die Regeneration des SAM-Analogons durch eine HMT-MT-Kaskadenreaktion erreicht. Artikel I Spezifische Reste erweitern den Substratumfang und erhöhen die Regioselektivität einer pflanzlichen O-Methyltransferase. In der Literatur wurde berichtet, dass ein Isoeugenol 4-OMT (IeOMT) durch Ersetzen von drei aufeinanderfolgenden Resten zu einem Kaffeesäure-3-OMT (CaOMT) verarbeitet werden kann. In diesem Artikel untersuchten wir die Wirkung dieser Reste auf die Substratpräferenz und Regioselektivität von IeOMT. Die Dreifachmutante T133M / A134N / T135Q und die jeweiligen Einzelmutanten wurden konstruiert und gegen eine Reihe von Phenolverbindungen getestet. Die Variante T133M hatte eine universelle Wirkung zur Verbesserung der enzymatischen Aktivitäten gegen alle getesteten Substrate, während die Mutante A134N eine erhöhte Regioselektivität aufwies. Die Dreifachmutante T133M / A134N / T135Q profitiert von diesen beiden Mutationen, die nicht nur den Substratumfang erweiterten, sondern auch die Regioselektivität von IeOMT erhöhten. Auf der Grundlage dieser Arbeit können regiospezifische methylierte Phenole durch verschiedene IeOMT-Varianten in hoher Reinheit hergestellt werden. Artikel II Einfluss von Substratbindungsresten auf den Substratumfang und die Regioselektivität einer pflanzlichen O-Methyltransferase gegen Flavonoide Flavonoid-OMTs (FOMTs), Isoflavonoid-OMTs (IOMTs) und Phenylpropanoid-OMTs (POMTs) weisen unterschiedliche Substratpräferenzen auf. Der Sequenzvergleich zeigte, dass die Substratbindungsreste an den Positionen 322 und 326 zwischen diesen OMT-Gruppen unterschiedlich sind und für die Substratunterscheidung kritisch sein könnten. Die Reste an den Positionen 322 und 326 in IeOMT (ein POMT) wurden zu den üblicherweise präsentierten Resten in FOMT und IOMT mutiert. Die eingeführten Mutanten haben in Zusammenarbeit mit der Variante T133M neue Aktivitäten und Regioselektivität gegenüber den getesteten Flavonoiden Eriodictyol, Naringenin, Luteolin, Quercetin und auch dem Isoflavonoid Genistein im Vergleich zum Wildtyp-IeOMT verbessert oder gebracht. Auf der Grundlage dieser Arbeit wurden methylierte Flavonoide, die in der Natur selten sind, in hoher Reinheit hergestellt. Artikel III Die gerichtete Entwicklung einer Halogenidmethyltransferase ermöglicht die biokatalytische Synthese verschiedener SAM-Analoga Biokatalytische Alkylierungen zur Gewinnung chemo‐, regio‐ und stereoselektiv alkylierter Verbindungen können durch MTs mit der Lieferung von SAM-Analoga erreicht werden. Kürzlich wurde entdeckt, dass SAM direkt aus S-Adenosyl-L-Homocystein (SAH) und Methyliodid synthetisiert werden kann, die durch ein HMT katalysiert werden. Um die Promiskuität von HMT bei der Synthese von SAM-Analoga zu untersuchen, führten wir eine gerichtete Evolution des HMT von Arabidopsis thaliana basierend auf einem sensitiven kolorimetrischen Iodid-Assay durch. Die identifizierte Variante V140T zeigte Aktivitäten gegen Ethyl-, Propyl- und Allyliodide, um die entsprechenden SAM-Analoga herzustellen. Mit dieser HMT-Variante wurden durch diese HMT-MT-Eintopf-Kaskadenreaktion eine regioselektive Ethylierung von Luteolin und eine Allylierung von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd sowie die Regeneration des SAM-Analogons erreicht.