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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002695-0

Next-generation sequencing for molecular epidemiology and comparative virulence analyses of epizootic and zoonotic pathogens

  • Next Generation Sequencing (NGS)-technologies developed very fast in recent years and is used widely in current research areas. The aim of this study was to use NGS (i) for the identification of pathogens in outbreaks and (ii) for the identification of virulence-relevant sequencepolymorphisms when comparing whole genome sequences. Therefore, a previous developed workflow was used to identify a new virus of the family Bornaviridae. The generation of whole genome sequences elucidated the molecular epidemiological connection of infection of variegated squirrels (Sciurus variegatoides) and three human cases of fatal encephalitis. By generating the whole genome sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) in Germany it was possible to find difference compared to circulating high virulent strains in the USA. This led to potential virulence marker to distinguish strain in the USA and Germany. Connections between sequence variation and virulence were further investigated for the bovine viral diarrhea virus 2c (BVDV-2c), cowpox viruses (CPXV) and classical swine fever virus (CSFV). Here, for a highly virulent BVDV-2c strain a mixture of different genome structure variants could be found. The majority of these genomes harbors a duplication within the p7/NS2 coding region and might cause a high virulence. For CPXV virus isolated of different hosts were analyzed and a correlation between genome sequence and the A-type inclusion body phenotype could be found. Furthermore, several deletion/insertion events were detected which might influence the virulence of these strains. Finally, the virus population of CSFV strains in pigs was characterized. However, the population of the inoculum as well as of acute-lethal and chronically infected animals gave no indication that the virus itself causes the different types of disease outcome. In conclusion, this thesis shows the great potential of NGS for virus identification and characterization. Furthermore, it makes the identification of potential virulence marker possible which subsequently can be analyzed by reverse genetics.
  • Die Next Generation Sequencing (NGS)-Technologie hat sich in den vergangenen Jahren rasant entwickelt und findet in der Gegenwart breite Anwendung in der Grundlagenforschung und anwendungsorientierten Forschung. Dazu zählen unter anderem Transkriptom- und Translatom-Analysen, die Bestimmung von regulatorischen Elementen und die Analyse von RNA-Sekundärstrukturen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential der NGS-Technologie (i) für die Identifizierung von Erregern bei Häufungen von Krankheitsfällen oder während Krankheitsausbrüchen bei Versagen der klassischen Diagnostikverfahren und (ii) für die Identifikation möglicher Virulenz-relevanter Sequenzpolymorphismen bei Komplettgenomvergleich zu erproben. Dazu wurde bereits im Vorfeld ein valider und sensitiver Workflow für die Sequenzierung und Datenanalyse entwickelt und bei der Metagenomanalyse eines neu entdeckten Virus aus der Familie Bornaviridae geprüft. Mittels der im Anschluss generierten Volllängengenomsequenzen dieses Virus konnte der molekular-epidemiologische Zusammenhang von Infektionen beim Bunthörnchen (Sciurus variegatoides) und drei Fällen von tödlich verlaufener Enzephalitis bei Hörnchenzüchtern bewiesen werden. Die Bestimmung der Komplettgenome des in Deutschland nachgewiesenen Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) mittels NGS konnte deutliche Sequenzunterschiede zu den in den USA zirkulierenden hochvirulenten Stämmen dieses Virus aufzeigen. Somit lieferte der Sequenzvergleich der generierten Volllängengenomsequenzen Hinweise auf potentielle Virulenzmarker der unterschiedlichen Virusstämme in den USA und Deutschland. Weitere Untersuchungen zu Zusammenhängen von Sequenzvarianten und Virulenz wurden für das das Bovine Virusdiarrhoe-Virus Genotyp 2c (BVDV-2c), das Kuhpockenvirus (CPXV) und das Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) durchgeführt. Dabei konnte für einen hochvirulenten, in Deutschland zirkulierenden BVDV-2c Stamm eine Mischung von verschiedenen Genomstrukturvarianten detektiert werden. Die Mehrheit dieser Varianten trug eine Duplikation im p7/NS2 kodierenden Bereich, die vermutlich im Zusammenhang mit der beobachteten erhöhten Virulenz steht. Diese Untersuchungen zeigten daneben auch, dass die Wahl des Datenanalyse-Algorithmus das Ergebnis beeinflusst. So wurden per de novo Assembly die entsprechenden Strukturvarianten detektieren, während diese mittels Referenzmapping unentdeckt blieben. Für CPXV wurden Isolate unterschiedlicher Wirtsherkunft, das heißt aus Feldmaus Microtus arvalis und Wanderratte Rattus norvegicus, untersucht und die Genomunterschiede mit dem in Zellkultur beobachtetem A-type inclusion body-Phänotyp in Zusammenhang gebracht. Des Weiteren wurden mittels Sequenzvergleich Deletions/-Insertionsereignisse in Virulenzfaktor-Genen detektiert die vermutlich im Zusammenhang mit der Virulenz dieser Isolate im natürlichen und zufälligen Wirt stehen. Abschließend wurden Viruspopulationen von verschiedenen CSFV-Stämmen in Schweinen charakterisiert. Die Zusammensetzung der Viruspopulationen im Inokulum, sowie akut-letal und chronisch infizierten Schweinen lieferte keine Hinweise auf bestimmte Genomregionen, die diese unterschiedlichen Krankheitsverläufe hervorrufen könnten. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit das große Potential der NGS-Technologie für eine detaillierte Viruscharakterisierung, die die Basis für die Identifikation möglicher Virulenzmarker darstellt, die anschließend mittels reverser Genetik-Verfahren geprüft werden müssen, und für die Entwicklung neuer diagnostischer Nachweisverfahren sowie die Prüfung molekular-epidemiologischer Zusammenhänge zoonotischer Virusübertragungen. Dieses Potential der NGS-Plattform wird zukünftig Eingang in die Routinediagnostik finden und damit zu einer Beschleunigung und Verfeinerung der molekularen Virus- und anderen Erregerdiagnostik führen.

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Metadaten
Author: Maria Jenckel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002695-0
Title Additional (English):Next-generation sequencing for molecular epidemiology and comparative virulence analyses of epizootic and zoonotic pathogens
Title Additional (German):Next-Generation Sequencing für molekulare Epidemiologie und vergleichende Virulenzanalysen von Tierseuchen- und Zoonoseerregern
Advisor:PD Dr. Rainer G. Ulrich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2017/01/24
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/05/11
Release Date:2017/01/24
Tag:Sequenzierung; molekulare Epidemiologie
Cowpox; Pestivirus; Sequencing; Virology; molecular epidemiology
GND Keyword:Pestivirus, Virologie, Kuhpocken
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Dxx Genetics and population dynamics / 92D20 Protein sequences, DNA sequences
92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Dxx Genetics and population dynamics / 92D30 Epidemiology