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Proteomanalysen von Burkholderia pseudomallei sowie Identifikation und Analyse von Mutanten mit anaeroben Wachstumsdefekten

  • Das gram-negative Stäbchenbakterium Burkholderia pseudomallei, Erreger der Melioidose, ist ein fakultativ intrazelluläres Pathogen. Ein detailliertes Wissen über das Proteom dieses Pathogens liefert eine wichtige Grundlage für das Verständnis der Pathomechanismen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden detailierte „reference maps“ des intra- und extrazellulären Proteoms von B. pseudomallei Stamm E8 erstellt. Es wurden hierbei insgesamt 353 intrazelluläre und 154 extrazelluläre Proteine identifiziert und anschließend einer funktionellen Klassifizierung unterzogen. Die „reference maps“ stellen ein wichtiges Werkzeug für weitere vergleichende Proteomanalysen dar. In weiterführenden Experimenten wurde das Proteom dreier Wildtypstämme verglichen. Hierbei zeigten sich insgesamt nur geringe Unterschiede zwischen den drei analysierten Stämmen E8, E212 und K96423. Die Proteomanalysen bestätigten die Ergebnisse der Genotypisierung – beide Ansätze ergaben eine engere Verwandtschaft der Stämme E212 und K96423 als mit Stamm E8. Im Infektionsverlauf von B. pseudomallei ist das sonst aerob lebende Bakterium in der Lage sich auch unter anaroben Bedingungen auszubreiten. Über die anaerobe Physiologie von B. pseudomallei ist bisher wenig bekannt. Es konnte ein Screeningsystem entwickelt werden, mit dem aus insgesamt 2344 Transposonmutanten 16 Mutanten mit reduziertem Wachtum unter anaeroben Bedingungen identifiziert wurden. Die vier Mutanten mit dem am stärksten verringerten Wachstum wurden für weitere Analysen im Rahmen dieser Arbeit ausgewählt. Drei der Mutanten hatten Molybdän bezogene Gendefekte und bei einer Mutante betraf der Gendefekt eine putative Sensor-Kinase. Die untersuchten Mutanten konnten erfolgreich komplementiert werden und somit polare Effekte ausgeschlossen werden. Die Komplentanten wiesen wieder dem Wildtyp entsprechendes anaerobes Wachstum auf und wiesen auch bei allen weiteren Experimenten, wie z.B. Infektionsversuchen, die Eigenschaften des Wildtyps auf. Dass unter den 2344 gescreenten Transposon Mutanten drei der vier auffälligsten Mutanten Molybdän bezogene Gendefekte aufwiesen, unterstreicht die Wichtigkeit von Molybdän und im Zusammenhang damit der anaeroben Nitratreduktase. Die Attenuierung der drei Mutanten im C57BL/6-Maus-Infektionsmodell deutet auf die Wichtigkeit des anaeroben Stoffwechsels bei chronischen Infektionsverläufen von B. pseudomallei hin. Bei der weiteren näher untersuchten Mutante liegt ein Defekt einer putativen Sensorkinase vor. Diese gehört zu einem Zwei-KomponentenSignaltransduktionssystem, welches Homologien zum RegB-RegA-System aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass die hier untersuchte Sensorkinase einen entscheidenen Einfluss auf die Virulenz von B. pseudomallei hat. Der exakte Mechanismus der Attenuierung durch die Mutation von BPSL0201 bleibt vorerst jedoch noch ungeklärt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dem hier entwickelten Screeningsystem erfolgreich Transposonmutanten identifiziert werden konnten, welche ein reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen aufweisen. Durch die anschließende Charakterisierung konnten tiefere Einblicke in den anaeroben Lebensstil von B. pseudomallei gewonnen werden. Die Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit des anaeroben Wachstums von B. pseudomallei und der vollen Virulenz hin. Die gewonnenen Erkenntnisse stimulieren weitere Untersuchungen im Hinblick auf den Einfluss des anaeroben Wachstums von B. pseudomallei bei der Pathogenese der Melioidose.
  • The gram-negative bacterium Burkholderia pseudomallei, cause of melioidosis, is a facultative intracellular pathogen. A detailed knowledge of the proteome of this pathogen provides an important basis for understanding the pathomechanisms. In this work, detailed "reference maps" of the intra- and extracellular proteome of B. pseudomallei strain E8 were constructed. A total of 353 intracellular and 154 extracellular proteins were identified and subsequently subjected to a functional classification. The "reference maps" are an important tool for further comparative proteome analyses. In further experiments the proteome of three wildtype strains was compared. All in all, the differences between the three strains E8, E212 and K96423 analysed were small. The proteome analyzes confirmed the results of the genotyping - both approaches showed a closer relationship between strains E212 and K96423 than with strain E8. In the course of the infection of B. pseudomallei, the otherwise aerobic living bacterium is able to spread even under anaerobic conditions. To date, little is known about the anaerobic physiology of B. pseudomallei. A screening system was developed, enabling to identify 16 mutants with reduced growth in anaerobic conditions from a total of 2344 transposon mutants. The four mutants with the most reduced growth were selected for further analyses within the scope of this work. Three of the mutants had molybdenum-related gene defects and in one mutant the gene defect affected a putative sensor kinase. The mutants studied were successfully complemented and polar effects were excluded. The complementants again showed the anaerobic growth corresponding to the wild type and also showed in all other experiments, e.g. Infection tests, the characteristics of the wild type. The fact that among 2344 transposon mutants, three of the four most striking mutants exhibited molybdenum-related gene defects emphasizes the importance of molybdenum and in connection with the anaerobic nitrate reductase. The attenuation of the three mutants in the C57BL/6 mouse infection model indicates the importance of anaerobic metabolism in chronic infection of B. pseudomallei. In another studied mutant, a defect of a putative sensorkinase is present. This belongs to a twocomponent signal transduction system which has homologies to the RegB-RegA system. It was shown that the sensorkinase investigated has a decisive influence on the virulence of B. pseudomallei. However, the exact mechanism of attenuation by the mutation of BPSL0201 remains unclear. In summary, the screening system developed here has successfully identified transposon mutants exhibiting reduced growth under anaerobic conditions. Through the subsequent characterisation, important findings on the anaerobic lifestyle of B. pseudomallei were obtained. The results suggest a link between the ability of the anaerobic growth of B. pseudomallei and the full virulence. The obtained findings stimulate further studies with regard to the influence of the anaerobic growth of B. pseudomallei in the pathogenesis of melioidosis.

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Metadaten
Author: Nikolai Meukow
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-24580
Title Additional (English):Proteomeanalyses of Burkholderia pseudomallei ans identification and analysis of mutants with anaerobic growth defects
Referee:Prof. Dr. Ivo Steinmetz, Dr. Heike Claus
Advisor:Prof. Dr. Ivo Steinmetz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/01/09
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2018/12/14
Release Date:2019/01/09
GND Keyword:Burkholderia, Mutante, Proteom, Pseudomallei, anaerob
Pagenumber:147
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie