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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001134-3

Nachweis von Plättchenfaktor 4 und Plättchenfaktor 4 Variante 1 nach in vitro Produktion

  • Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparintherapie. Dabei erfolgt zwischen dem Protein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin eine Komplexbildung, welche wichtig für die krankheitsauslösende Bildung des Antigens ist. Von PF4 existiert eine beim Menschen vorkommende Variante, Plättchenfaktor 4 Variante 1 (PF4var1). Bei PF4 und PF4var1 handelt es sich um Proteine non-alleler Gene. Die Proteine unterscheiden sich an 3 Stellen ihrer Aminosäuresequenz. PF4var1 ist weniger positiv geladen, wodurch die Wechselwirkung mit Heparin beeinflusst wird. Die veränderte Sequenz beeinflusst die Eigenschaften der Proteine. So weist PF4var1 stärkere chemotaktische und anti-angiogenetische Eigenschaften auf als PF4. Auch bei den Signalpeptiden der beiden Proteine liegt eine Änderung vor. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst mit PF4 bzw. PF4var1 kodierendem Gen transformierte humane embryonale Nierenzellen in unterschiedlichen Nährmedien kultiviert. Die Zelllinien wurden hinsichtlich der Produktion, Expression und Sekretion der Proteine PF4 bzw. PF4var1 untersucht. Die angewendeten Untersuchungs¬methoden zur Expression (FACS) bzw. zur Sekretion (ELISA) ermöglichten den Nachweis der Proteine. Eine Differenzierung zwischen PF4 und PF4var1 ist hiermit nicht möglich. Allerdings zeigte die Sequenzierung der Aminosäurestrukturen und der DNA das spezifische Vorliegen von entweder PF4 oder PF4var1. Zur Herstellung von Antikörpern gegen PF4var1 werden große Mengen an PFvar1 benötigt. Da, auch nach Einsatz des Minifermenters, durch die humanen Zellen keine ausreichende Proteinproduktion möglich war, wurde E. coli mit der genetischen Information für PF4 transformiert. Gleiches wurde mit PF4var1 durchgeführt. Hierdurch ist eine Proteinproduktion in größerem Maßstab möglich. Zur Aufreinigung der Proteine mussten spezielle Pufferlösungen eingesetzt werden. Für PF4var1 wurden neu entwickelte Puffer eingesetzt. Derart aufgereinigte Proteine konnten in ESI-ToF-Experimenten erfolgreich unterschieden werden. Durch die hier vorgestellten methodischen Fortschritte dürfte es in nächster Zeit möglich sein neue Erkenntnisse des Zusammenspiels zwischen PF4var1 und HIT zu erlangen.
  • Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is a severe, immune mediated complication of heparin therapy. Complexes of platelet factor 4 (PF4) and heparin are important for formation of the antigen involved in HIT. Besides PF4, platelet factor 4 variant 1 (PF4var1) exists. The genes for PF4 and PF4var1 are non-allelic genes with considerable differences. The two resulting proteins differ in 3 positions of their amino acid sequence in the lysine-rich region. PF4var1 is therefore less positively charged compared to PF4 and binds less strongly to heparin. PF4var1 also differs from PF4 in some biological characteristics. It has stronger chemotactic and antiangiogenetic effects. This thesis assessed methods to culture human embryonic kidney cells transfected with the genes for PF4 and PF4var1, respectively. The cell lines were kindly provided by Prof Romagnani, University of Florence and studied in regard to production, expression and secretion of PF4 and PF4var1, using different culture media. The applied methods were flow cytometry and enzyme immuno assays, which, however, did not allow differentiation between PF4 and PF4var1. We therefore applied direct protein sequencing and mass spectrometry analyses to further characterize the proteins secreted by the transfected cell lines. To study the role of PF4var1 in HIT, relatively large amounts of the protein are required. This was not possible using the transfected cell lines. We therefore used transfected E. coli for large-scale production of PF4 and PF4var1. While recombinant PF4 could be purified by similar protocols as established for platelet derived PF4, new protocols were developed for purification of PF4var1. The presented methods allow production of recombinant PF4var1 and thereby provide the basis for further studies on the role of PF4var1 in HIT.

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Metadaten
Author: Marie-Luise Gaus
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001134-3
Title Additional (English):Analysis of Platelet Factor 4 and Platelet Factor 4 variant 1 after in vitro production
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/12/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/11/14
Release Date:2011/12/07
Tag:CXCL4, CXCL4L1, Plättchenfaktor 4, Plättchenfaktor 4 var1, humane embryonale Nierenzellen
CXCL4, CXCL4L1, E.coli, HEK
GND Keyword:Heparin
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Transfusionsmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit