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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-30535

Molekularbiologische und physiologische Charakterisierung einer Subtilase aus dem Wurzelexsudat von Nicotiana tabacum

  • Durch zymografische Untersuchungen und Massenspektrometrie (MS) wurden neun Proteasen vom Subtilisin-Typ im Wurzelexsudat von Nicotiana tabacum identifiziert. Ein Peptid-Antikörper wurde produziert, der die affinitätschromatografische Anreicherung einer tobacco root exuded subtilase (TREXS, XP_016501597.1) und zweier Isoformen sowie eines Peroxidase-artigen und eines SERK2-artigen Proteins ermöglichte. Basierend auf dem Subtilase-EST, der in der MS identifiziert worden war, wurde die full-length cDNA von TREXS durch 5'RACE und 3'RACE sequenziert und die gDNA kloniert. Das intronfreie TREXS-Gen codiert eine 756 Aminosäuren lange Subtilase mit Signalpeptid, I9-Inhibitordomäne, PA- und Fn-III-artiger Domäne. Der Nachweis von TREXS-mRNA in Blattgewebe zeigte, dass TREXS nicht exklusiv auf Wurzeln beschränkt ist. Phylogenetische Analysen zeigten, dass SDD1 die ähnlichste Subtilase aus A. thaliana zu TREXS ist. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist TREXS jedoch nicht das Ortholog zu SDD1, weil zum einen strukturähnlichere Subtilasen zu SDD1 in Tabak existieren und zum anderen SDD1 an der Ausprägung von Stomata in der Blattepidermis beteiligt ist, TREXS hingegen im Wurzelexsudat vorkommt. Das MS-identifizierte SERK2-artige Protein, das bei der Peptid-Antikörper-Affinitätschromatografie zusammen mit TREXS angereichert wurde, ist Kandidat als Substrat für TREXS, weil es potenziell durch IgG–TREXS–SERK2-like-Interaktion co-angereinigt wurde, die in-silico docking-Vorhersagen zwischen den modellierten Molekülen von TREXS und SERK2-like einen proteolytisch relevanten Bindungszustand vorhersagt und es strukturelle Ähnlichkeit mit LRP, einem bekannten Substrat der Subtilase P69C, hat. Die transiente Expression rekombinanter TREXS in N. benthamiana war möglich, zeigte sich jedoch kritisch gegenüber C- und N-terminal fusionierten Anhängen: Transiente Transformation mit TREXS oder TREXS:Strep-tag führte zu proteolytisch aktivem Protein. Jedoch war der C-terminale Strep-tag nicht funktionell. Längere C-terminale Anhänge und auch TREXS-Mutanten mit inaktiviertem katalytischen Zentrum erbrachten kein Genprodukt. C-terminales GFP erbrachte – auch bei mutiertem katalytischen Zentrum – stets nur den GFP-Anteil des Fusionsproteins.
  • The proteolytic activities of chromatographically enriched Nicotiana tabacum root exudate were visualized by zymography. Nine serine proteases of the subtilase type were identified in the tobacco root exudate by mass spectrometry. The sequence of one subtilase was obtained by rapid amplification of cDNA ends (RACE)-techniques revealing typical structural features of plant subtilases. The novel tobacco root exuded subtilase was named TREXS. IgG affinity chromatography of TREXS co-purified two TREXS-isoforms and two non-proteolytic proteins: an anionic peroxidase-like and a SERK2-like protein. Both could potentially be substrates of TREXS. The molecules of TREXS and SERK2-like could be modeled with high confidence and were subjected to a docking prediction. A potential binding state of TREXS and SERK2-like with less than 5 Å distance between TREXS’ catalytic triade and the SERK2-like backbone chain renders hydrolytic cleavage of SERK2-like by TREXS probable.

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Metadaten
Author: Tim Wendlandt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-30535
Title Additional (English):Molecular biological and physiological characterization of a root-exuded subtilase from Nicotiana tabacum
Referee:Prof. Dr. Christine Stöhr, Prof. Dr. Andreas Schaller
Advisor:Prof. Dr. Christine Stöhr
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/09/23
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/09/05
Release Date:2019/09/23
Tag:Protease, Serinprotease, Subtilase, Wurzelexsudat
GND Keyword:Biologie, Pflanzenphysiologie
Pagenumber:160
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Botanik und Landschaftsökologie & Botanischer Garten
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie