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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001161-3

Etablierung und Verwendung von humanen Keratinozytenmodellen zur Auffindung von Naturstoffen mit UV-schützenden und regenerationsfördernden Wirkstoffen

  • In Anbetracht der zunehmenden UV-Intensität und des Wissens um die Spätfolgen jedes einzelnen Sonnenbrandes besteht ein großes Interesse an UV-protektiven Wirkstoffen. Daher war es Ziel dieser Arbeit, neue Wirkstofflieferanten aus der Natur für diese Anwendung zu identifizieren. Ein breites Spektrum von verschiedenen Organismen wurde auf ihre protektiven oder regenerativen Effekte auf UVB-behandelte Keratinozyten hin gescreent und anschließend vielversprechende Naturstoffe ausgewählt und genauer untersucht. Zusätzlich war die Auffindung von vitalitätssteigernden sowie zytotoxisch wirkenden Extrakten und Reinstoffen von Interesse. Dazu wurden zunächst in vitro Testmodelle auf Basis der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT etabliert und die Wirkung von UVB-Strahlung auf diese Zellen charakterisiert. Genutzt wurden der MTT-Assay zur Bestimmung der Vitalität und Proliferation, der Neutralrot-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran und Proliferation und der Lactatdehydrogenase-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran. Mittels Durchflusszytometer wurden Zellzyklusanalysen durchgeführt, sowie zur Erfassung von DNA-Schäden die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay), außerdem wurde mit Hilfe des Interleukin-6-Assays die zelluläre Zytokinproduktion gemessen. Nach Bestrahlung der HaCaT-Zellen mit UVB ergaben sich zeit- und dosisabhängig folgende wesentliche Effekte: Ein leichter G2/M-Arrest bei geringeren UVB-Dosen (10mJ/cm2-30mJ/cm2), ein G0/G1-Arrest bei höheren UVB-Dosen (50mJ/cm2 und 100mJ/cm2), die dosisabhängige Zunahme des subG1-Peaks (Apoptoseinduktion), die Zunahme der LDH-Freisetzung mit steigender UVB-Dosis, die Stimulation der IL-6-Produktion mit steigender UVB-Dosis, sowie eine dosisabhängige Schädigung der DNA sowohl sofort nach UVB-Bestrahlung als auch nach 24 stündiger Inkubation. Nach Testung verschiedener UVB-Dosen und unterschiedlicher Inkubationszeiten wurde zur Untersuchung der Naturstoffe mit einer Dosis von 20mJ/cm2 UVB und einer Inkubationszeit von 24 Stunden gearbeitet. Die Testung auf UV-protektive Wirkungen der Extrakte gegenüber DNA-Schäden anhand des Comet Assays erfolgte direkt nach UVB-Bestrahlung. In dieser Arbeit wurden insgesamt 100 verschiedene Extrakte und 12 Reinsubstanzen allein oder in Kombination mit UVB-Strahlung untersucht. Die getesteten Naturstoffe stammten von Algen, Cyanobakterien, terrestrischen und marinen Pilzen, sowie von Pflanzen. Im Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse aufgelistet: Eine vitalitätssteigernde Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 33 Extrakte und Reinsubstanzen. Durch die Inkubation mit 12 Naturstoffen konnte ein Serummangel-induzierter G0/G1-Zellzyklusphasenarrest bei den HaCaT-Zellen verhindert oder überwunden werden. Ein durch UVB-Strahlung induzierter G2/M-Zellzyklusarrest konnte durch Inkubation der Zellen mit 9 Naturstoffen verhindert oder überwunden werden. 11 Naturstoffe führten zu einer verminderten Lactatdehydrogenase-Freisetzung UVB-bestrahlter Zellen. 5 Naturstoffe hemmten die UVB-induzierte IL-6-Produktion der Zellen. 15 Naturstoffe führten auf unterschiedlichen Wegen zu einer Verminderung UVB-bedingter DNA-Schäden an HaCaT-Zellen. Eine zytotoxische Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 58 Extrakte und Reinsubstanzen Anhand der Ergebnisse sind die drei terrestrischen Pilze Inonotus nodulosus, Piptoporus betulinus und Tricholoma equestre, sowie die beiden Pflanzen Annona muricata und Harpephyllum caffrum aussichtsreiche Kandidaten für eine zukünftige Anwendung als Hautschutz- oder Hautpflegemittel. Des Weiteren haben auch die Extrakte von Nannochloropsis spec., Ganoderma lucidum, Ganoderma pfeifferi, Hydnotrya michaelis, Tricholoma populinum und Tamarix aphylla auffällige Ergebnisse geliefert und verdienen weiteres Interesse. Die Ergebnisse zeigen die Eignung der etablierten Testmodelle zur Auffindung von Wirkstoffen mit UV-protektiven und weiteren Effekten auf Hautzellen. Gleichzeitig wird auch das große Potential von Organismen verschiedener Gruppen zur Bildung von Naturstoffen mit derartigen Eigenschaften deutlich.
  • Facing the increasing ultraviolet radiation reaching the surface of our planet and the knowledge of the long term effects of any single sunburn there is a rising interest in photoprotective agents. Therefore, the aim of this study was to identify new sources of natural products with UV protecting and regenerating activities. A broad spectrum of different organisms of specific interest (terrestrial and marine fungi, macro- and microalgae, plants) were screened for protective or regenerative effects on UVB irradiated HaCaT cells. Thereafter, promising natural product sources were selected and investigated more detailed. Additionally, compounds which lead to an increasing viability or which exhibited a cytotoxic activity on keratinocytes should be identified. For that purpose different in vitro test models using the human keratinocyte cell line HaCaT had initially to be established and the effects of UVB irradiation on these cells had to be characterised. Among the established assays are the MTT assay for determination of viability and proliferation, the neutral red assay for designation of cell integrity and proliferation, the lactate dehydrogenase assay for identification of cell membrane integrity, the interleukin-6 assay for measurement of cellular cytokine release, the acquisition of cellular DNA damage by the comet assay (single cell gel electrophoresis) and the flow cytometer based cell cycle analysis. The following incubation time and UVB dose dependent effects were observed with the established assays after irradiation of human keratinocytes: A slight G2/M arrest at lower UVB dose rates (10mJ/cm2-30mJ/cm2), a G0/G1 arrest at higher UVB dose rates (50mJ/cm2 and 100mJ/cm2), a dose dependent increase of the subG1-peak (induction of apoptosis), an increase of LDH release with ascending UVB dose rates, a stimulation of IL-6 production with rising UVB dose rates, as well as a dose dependent DNA damage of cells directly after irradiation and also after 24 hours of incubation. After investigation of different UVB dose rates and varying incubation procedures a UVB dose of 20mJ/cm2 and an incubation time of 24 hours were selected for the testing of crude extracts and isolated compounds. The analysis of protective activities of extracts against UVB induced DNA damage using the comet assay took place directly after irradiation of the cells. In this study a total of 100 different crude extracts and 12 isolated compounds were tested alone or in combination with UVB irradiation. The tested natural products belonged to algae, cyanobacteria, terrestrial and marine fungi, and plant kingdom. The major results are: Incubation with 33 crude extracts and compounds lead to an increase of HaCaT cell viability. After treatment with 12 natural products the cells were able to avoid or to overcome the serum deprivation induced G0/G1 cell cycle arrest. After incubation with 9 natural products HaCaT cells were able to avoid or to overcome the UVB induced G2/M cell cycle arrest. Incubation of UVB irradiated HaCaT cells with 11 natural products lead to a diminished release of lactate dehydrogenase. Incubation of HaCaT cells with 5 natural products inhibited the UVB induced IL-6 production by the cells. 15 natural products were able to decrease the UVB irradiation caused DNA damage of HaCaT keratinocytes in different ways. Cytotoxic activities on HaCaT cells were shown by 58 crude extracts and isolated compounds. On the basis of these results the three terrestrial fungi Inonotus nodulosus, Piptoporus betulinus and Tricholoma equestre, as well as the two plants Annona muricata and Harpephyllum caffrum were identified to be promising candidates for the application as skin UVB protecting or general skin care products. Beyond that also the cyanobacterium Nannochloropsis spec., the medicinal mushrooms Ganoderma lucidum, Ganoderma pfeifferi, Hydnotrya michaelis and Tricholoma populinum and the plant Tamarix aphylla showed striking results in some assays and are worthy of a closer look in future studies. In conclusion, these results show the suitability of the established in vitro models for the detection of natural products with UV protecting and regenerating activities on human keratinocytes. Moreover, this study reveals a great potential of different groups of organisms for the production of active compounds with such desirable effects.

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Metadaten
Author: Manuela Harms
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001161-3
Title Additional (English):Application of human keratinocyte models for detection of natural products with UV protecting and regenerating activity
Advisor:Dr. Kristian Wende, Prof. Dr. Ulrike Lindequist
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/01/13
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/08/17
Release Date:2012/01/13
Tag:HaCaT, UV-Schutz
HaCaT, UVB, keratinocytes, natural products
GND Keyword:Hautzelle, Naturstoff, Ultraviolett B, Zellkultur
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie