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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001121-6

Molekulare Untersuchungen zur Virulenz und Wirtsadaptation von Influenza-A-Viren vom Subtyp H5N1 an Geflügel und Säuger

  • Influenza-A-Viren sind wichtige Pathogene von Mensch und Tier. Als Erreger der klassischen Geflügelpest führen hoch-pathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) weltweit zu hohen Verlusten in der Geflügelindustrie. Des Weiteren stellen der zoonotische Charakter und das pandemische Potential, vor allem von Stämmen des Subtyps H5N1, eine ernste gesundheitliche Bedrohung für die Bevölkerung dar. Zur Risikobewertung dieser Viren ist es daher notwendig, genetische Marker zu ermitteln, welche die Virulenz und das Wirtsspektrum beeinflussen. Für die Identifizierung dieser Virulenzdeterminanten sind Pathogenese-Studien in verschiedenen Tiermodellen wie Hühnern und Mäusen essenziell. Bisher wurde gezeigt, dass HPAIV aus niedrig-virulenten Vorläufern durch den Erwerb eines polybasischen Spaltmotives im Hämagglutinin (HA) im Zuge der Adaptation an terrestrisches Geflügel hervorgehen. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher die Fähigkeit eines niedrig-pathogenen aviären Influenzavirus (LPAIV) vom Subtyp H5N1 zur Ausbildung eines HPAIV-Phänotyps untersucht werden. Dazu wurde das revers-genetische System für das Isolat A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) etabliert und das Virus TG05 generiert. In-vitro konnte die Trypsin-Abhängigkeit als Merkmal von LPAIV bestätigt werden. Im Huhn verhielt sich dieses Virus avirulent. Durch zielgerichtete Mutagenese wurde die HA-Spaltstelle in ein polybasisches Motiv mutiert und das Virus TG05poly generiert. Das Virus war wie ein HPAIV zur in-vitro-Replikation ohne Trypsin-Zusatz fähig, löste aber nach der Infektion von Hühnern nur eine zeitlich begrenzte Erkrankung aus. Des Weiteren wurde die HA-Reassortante TG05-HAR65 generiert, deren Genom aus dem HA-Gen des HPAIV-Isolates A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) und den anderen sieben Gensegmenten von TG05 besteht. Dieses Virus konnte in-vitro ebenfalls Trypsin-unabhängig replizieren, führte aber zu einer Letalität von 30%. Eine weitere Reassortante, R65-HATG05poly, enthielt die umgekehrte Genkonstellation: das mutierte TG05-HA und die anderen Gensegmente des R65. An der Infektion verstarben acht von zehn Hühnern, was der Letalität von „natürlichen“ HPAIV entspricht. Der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle ist daher ein notwendiger, aber nicht hinreichender Schritt in der Evolution von LPAIV zu HPAIV. So kann nicht jeder H5- oder H7-LPAIV-Stamm als unmittelbarer HPAIV-Vorläufer dienen. Zusätzlich zur HA-Spaltstelle sind weitere Virulenz-Determinanten im HA selbst, aber auch in den anderen viralen Proteinen, vorhanden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher auch der Einfluss der Aminosäuren der unmittelbaren Spaltstellen-Umgebung untersucht. Dazu wurden verschiedene Virus-Mutanten des R65 mit Aminosäure-Substitutionen in der HA-Spaltstelle selbst (Motive ETR und ER) und in ihrer direkten Umgebung (HA-S346V) generiert und hinsichtlich der in-vitro-Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HA-346S einen Vorteil für die Replikation von LPAIV und HPAIV vermittelt. T an Position 2 der Spaltstelle unterstützt die Replikation von LPAIV. Bei Erwerb der polybasischen Spaltstelle während der Evolution von LPAIV zu HPAIV müssen also auch die benachbarten Regionen im HA angepasst werden. Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich über infizierte Vögel von Südostasien nach Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von Säugerspezies. Normalerweise weisen aviäre Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K, was sonst in humanen Stämmen zu finden ist. Um im dritten Teil dieser Arbeit den Einfluss dieser Mutation auf das breite Wirtspektrum der Clade 2.2-Viren zu untersuchen, wurde im HPAIV-Isolat R65 PB2-627K durch E ersetzt und die Virusmutante R65-PB2K627E generiert. Im Vergleich zu R65 war die Replikation von R65-PB2K627E in Säugerzellen drastisch reduziert, in Vogelzellen replizierten beide Viren jedoch gleich. Des Weiteren führte die Substitution zu einer extrem verringerten Polymerase-Aktivität auf 5% in Säugerzellen, aber nur zu einer vergleichsweise wenig verringerten Aktivität in Vogelzellen. Während die Virulenz im Huhn durch die Mutation nicht verändert wurde, konnte bei der Bestimmung der LD50 in der Maus eine drastische Attenuierung gezeigt werden. Interessanterweise revertierte bereits nach einer Mauspassage PB2-K627E zurück zu K, im Huhn erfolgte diese Reversion aber nicht. Um zu untersuchen, ob andere virale Proteine für diese Reversion notwendig sind, wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder mehrere Gensegmente des R65 im Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1) tragen, welches natürlicherweise PB2-627E besitzt. Mittels Zellkultur-Passagen dieser Reassortanten konnte gezeigt werden, dass die Reversion zu PB2-627K nur in Säugerzellen auftritt, und dass dazu das Nukleoprotein des R65 notwendig ist. Die schnelle Reversion zu PB2-627K in Säugerzellen und in Mäusen zeigt, dass die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 in ihrer Evolution möglicherweise mehrere Wirte gehabt haben, zu denen wahrscheinlich auch Säuger gehörten.
  • Influenza A viruses are important pathogens of humans and animals. As the causative agent of fowl plaque, highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) lead to devastating losses in the poultry industry world-wide. Furthermore, their zoonotic character and pandemic potential, especially of strains with subtype H5N1, represents a serious threat to human health. The identification of genetic markers determining virulence and host range is important for risk assessment of new emerging strains. Studying virus pathogenesis in different animal models like chickens and mice is crucial to elucidate these virulence determinants. HPAIV evolve from precursors of low virulence by the acquisition of a polybasic cleavage site motif within the hemagglutinin (HA) during the adaptation to terrestrial poultry. Therefore, the ability of a low pathogenic avian influenza virus (LPAIV) of subtype H5N1 to transform into an HPAIV was investigated in the first part of this work. To this end, the reverse genetic system was established for the LPAIV A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) to generate TG05. In in-vitro studies, this virus was dependent on trypsin and proved to be avirulent in chicken. Its HA cleavage site was modified by site-directed mutagenesis to a polybasic motif resulting in the virus TG05-HApoly. This mutant was able to replicate in the absence of trypsin, but led only to transient disease in chicken. Furthermore, the reassortant virus TG05/HAR65 was generated, whose genome consists of the HA gene from the HPAIV isolate A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) and the other seven gene segments from TG05. This virus also replicated independently of trypsin but caused a lethality of 30%. However, another reassortant virus, R65/HATG05poly, with reverse genome constellation: the modified TG05 HA and the other gene segments of R65, caused death in eight of ten infected chickens, reminiscent of the lethality of natural´ HPAIV. Therefore, acquisition of a polybasic motif at the HA cleavage site is a necessary, but not sufficient step in the evolution of LPAIV into HPAIV. Furthermore, not every H5 or H7 LPAIV strain may serve as a precursor for HPAIV. In addition to the polybasic HA cleavage site, other virulence determinants reside in the HA itself, but also in the other viral proteins. In the second part of this work, the involvement of amino acids adjacent to the HA cleavage site was investigated. Therefore, different mutants of R65 with amino acid substitutions in the HA cleavage site itself (motifs ETR and ER) and in the proximate vicinity (HA-S346V) were generated and compared in regard to in-vitro replication and virulence. It was shown that HA-346S facilitates replication of LPAIV and HPAIV and T at position 2 of the cleavage site is beneficial to LPAIV. Thus, acquisition of a polybasic motif at the HA cleavage site during the evolution of LPAIV to HPAIV involves the accompanying adaptation of adjacent regions. H5N1 HPAIV of clade 2.2 have spread from Southeast Asia to Europe by infected birds, but also infected several mammalian species. Avian influenza viruses normally possess PB2-627E, but the clade 2.2 viruses harbor PB2-627K which is usually found in human strains. The third part of this work was therefore to elucidate the relevance of the PB2-627K mutation for the broad host range of the HPAIV H5N1 clade 2.2 strains. K was changed to E in R65, resulting in the mutant virus R65-PB2K627E. Compared to R65, multicycle growth of R65-PB2K627E was considerably impaired in mammalian, but not in avian cells. Furthermore, the substitution severely decreased polymerase activity in mammalian cells to 5%, but reduced activity only moderately in avian cells. Whereas virulence in chickens remained unaffected, the LD50 in mice was increased by three orders of magnitude. Strikingly, R65-PB2-K627E reverted to PB2-627K after one passage in mice, however not in chickens. To elucidate whether other viral proteins are required for this reversion, reassortant viruses were generated carrying R65-PB2-K627E and one or more gene segments of R65 in the background of HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1), which naturally possesses PB2-627E. Passage of these reassortants revealed that reversion to PB2-627K occurred only in mammalian cells in the presence of R65-NP. Overall, fast reversion to PB2-627K in mammalian cells and in mice suggests that the clade 2.2 H5N1 HPAIV could have a history of several, perhaps mammalian hosts.

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Metadaten
Author: Jessica Bogs
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001121-6
Title Additional (English):Molecular investigations of virulence and host adaptation of Influenza A Viruses of subtype H5N1 to poultry and mammals
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/11/23
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/11/21
Release Date:2011/11/23
Tag:Adaptation, Hämagglutinin, PB2, Polyerase-Komplex, reverse Genetik
PB2, adaptation, hemagglutinin, polymerase complex, reverse genetics
GND Keyword:BALB/c Maus, Geflügel, Geflügelpestvirus, Influenza-A-Virus, Pathogenität, Virulenz, Vogelgrippe
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie