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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002556-2

Characterization of resident Sca-1 progenitor cells in the failing murine heart

  • Heart Failure is currently the most common cardiac disorder and a major public health concern worldwide. The adult mammalian heart harbors a subpopulation of cardiac progenitor cells (CPC) that are capable of improving cardiac function. The scope of this study was to delineate the molecular phenotype of a subpopulation of CPCs characterized by the expression of the stem cells antigen-1 surface marker (Sca-1+) and to further identify molecular alterations occurring under heart failure conditions. In order to understand the underlying cellular mechanisms an integrated approach of proteomics and transcriptomics-based techniques were employed. The first step towards achieving this goal was to unravel the native Sca-1+ cell characteristics of freshly isolated progenitor cells derived from healthy adult murine hearts. The proteome map of Sca-1 cells was established using a gel-based mass-spectrometry (gel LC-MS/MS) approach. For better interpretation, a comparison with the protein profiles of cardiomyocytes and Sca-1- cells obtained under similar experimental conditions was performed. All three cell-types were morphologically different in size and structure, which was also evident from their protein expression profiles. We observed that Sca-1+ cells lack endothelial-like and cardiac contractile phenotypes, unlike Sca-1- cells and cardiomyocytes, respectively. Functional assessment of both protein and gene expression profiles revealed a possible role of Sca-1+ cells in cell adhesion, migration, and proliferation. CPC remain in a dormant state under physiological condition unless challenged by myocardial injury. Previous studies revealed that resident Sca-1+ cells home to the injured myocardium but not to the healthy heart and further differentiate into functional cardiomyocytes. We investigated the molecular background of this behavior of adult Sca-1+ cells under heart failure condition which might provide a better insight into their cardiogenic potential in a pathological milieu. The double transgenic α-myosin heavy chain (MHC)-cyclin T1/Gαq overexpressing mouse was chosen as a model for heart failure. Using the comparative gene expression profiling we could detect the differential regulation of 197 genes with at least a 2-fold difference. Among these BDNF mRNA levels were 5-fold higher in the Sca-1+ cells derived from transgenic mice (Cyc+) in comparison to that of wild-type controls (Wt+). This difference was also observed at protein level. The substantially higher expression of BDNF during heart failure prompted us to investigate its regulatory effect on Sca1+ cells. In this current study we were able to show that small amounts of exogenous BDNF stimulated the migratory potential of Cyc+ cells. This effect was not seen in treated Wt+ cells. Furthermore, pulsed SILAC was employed to monitor BDNF mediated changes following treatment. After BDNF treatment, 58 proteins were differentially regulated of which proteins related to cell proliferation were reduced in level in Cyc+ cells while they displayed increased levels in Wt+ cells. Findings from bromodeoxyuridine (BrdU) assays and immunoblotting indicated that BDNF might initiate a differentiation program by repressing cell proliferation in Cyc+ cells. Taken together, it could be shown that the BDNF effect on protein synthesis of Cyc+ and Wt+ cells varied considerably, suggesting an improvement of the cardiogenic potential of Sca-1+ cells under pathological conditions. Aldosterone levels are known to be elevated during heart failure. In this part of study it was hypothesized that endocrine factors associated with heart failure might influence the migration of CPC, thereby possibly restoring the cardiac function of diseased hearts. It could be shown that high concentrations of aldosterone, similar to those found in the plasma of heart failure patients, induced the migration of Sca-1+ cells by up to 60% when compared to control, while physiological levels had no significant influence. In addition, it could be demonstrated that the aldosterone stimulus led to the activation of the mineralocorticoid receptor (MR) expressed on Sca1+ cells, which in turn facilitated migration. This was supported by application of MR antagonist eplerenone, which significantly reduced the aldosterone-induced increase in cell migration while a glucocorticoid antagonist exhibited no inhibitory effect. Hence, the results support the potential role of aldosterone in the mobilization of CPC. It is currently believed that the beneficial effects of cell-based therapies on cardiac repair are imparted to a large degree via paracrine mechanisms. We therefore focused on understanding the influence of pathophysiological levels of aldosterone on the extracellular environment of Sca-1+ cells. MS-based secretome profiling of cells treated for 24h with aldosterone treatment revealed higher levels of proteins associated with extracellular matrix remodeling and IGF signaling. Additionally, galectin-1 and gelsolin were significantly increased in level under pathological conditions indicating a possible paracrine tissue repair of Sca-1+ cells. To conclude, the global proteome and transcriptome profiles generated here revealed the molecular phenotype of Sca-1+ cells which may be used for future reference. The comparative microarray study provided deeper insight into the endogenous changes in mRNA expression during heart failure and delineated the cardiogenic characteristics of Sca-1+ cells. Moreover, the data presented here shed new light on the potential role of BDNF in regulating the mobilization and proliferation of CPCs. Our study on the influence of aldosterone on the migration and the extracellular proteome of CPCs provided new insights on the beneficial effects of this mineralocorticoid on cardiac cells.
  • Die Herzinsuffizienz als häufigste kardiale Erkrankung stellt weltweit ein großes gesellschaftliches Gesundheitsproblem dar. Im Herz adulter Säugetiere findet sich eine Subpopulation von kardialen Progenitorzellen (CPC), die in der Lage ist, die Herzfunktion zu verbessern und sogar geschädigtes Gewebe wieder herzustellen. Das Verständnis der Funktion und Differenzierung dieser Zellpopulation ist jedoch bisher noch unzureichend. Im Zentrum dieser Arbeit stand daher die Charakterisierung des molekularen Phänotyps einer Untergruppe von Progenitorzellen, die durch die Expression von Stammzellantigen-1 (Sca-1) auf ihrer Oberfläche charakterisiert wird, sowie die Identifikation von Veränderungen, die im Rahmen einer Herzinsuffizienz in diesen Zellen auftreten. Um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen zu verstehen, wurden unter den verschiedenen Bedingungen die Genexpression und das Proteinmuster der Zellen analysiert und diese im Zusammenhang mit Ergebnissen zellbiologischer und biochemischer Experimente interpretiert. Im ersten Schritt erfolgte dabei die Analyse frisch isolierter und unbehandelter Sca-1+ Zellen, die aus den Herzen gesunder adulter Mäuse gewonnen wurden. Die Proteomkartierung der Progenitorzellen erfolgte mit Hilfe eines massenspektrometrisch nach Vortrennung der Proteine im 1D-Gel (Gel LC-MS/MS). Für die Interpretation der Ergebnisse im Myokard, wurden zum Vergleich Proteomprofile von Kardiomyozyten und Sca-1 negativen (Sca-1) Zellen unter vergleichbaren experimentellen Bedingungen angefertigt. Alle drei Zelltypen unterschieden sich morphologisch in Größe und Struktur, was sich auch in den Proteinprofilen bestätigte. Während Sca-1- Zellen einen endothelzellähnlichen Phänotyp aufwiesen und die Kardiomyozyten sich durch kontraktile Elemente auszeichneten, fehlten beide Charakteristika bei den Sca-1+ Zellen. Die funktionelle Analyse der Proteine und der Genexpression der Progenitorzellen weist auf eine mögliche Beteiligung der Sca-1+ Zellen an Zelladhäsion, Migration und Proliferation und somit auf eine Rolle der Population bei der kardialen Entwicklung und Selbstregulation hin. CPCs verbleiben unter physiologischen Bedingungen in einem Ruhezustand, bis sie durch eine myokardiale Schädigung aktiviert werden. Frühere Studien zeigen, dass residente Sca-1+ Zellen in Richtung von geschädigtem Myokard, nicht aber gesundem Herzgewebe wandern und dort zum Teil in neue Kardiomyozyten differenzieren. Der molekulare Hintergrund dieses Verhaltens der Progenitorzellen im Rahmen einer Herzinsuffizienz, welcher möglicherweise Aufschluss über das kardiogene Potential der Zellen unter pathologischen Bedingungen gibt, wurde daher näher untersucht. Als Tiermodell für die Herzinsuffizienz wurde dabei die α-Myosin Heavy Chain (MHC)-CyclinT1/Gαq Maus ausgewählt, welche zum einen eine forcierte Expression von CyclinT1 und zum anderen eine Überexpression der Gαq-Untereinheit, aufweist. Unter Zuhilfenahme der vergleichenden Genexpressionsanalyse konnten 197 differentiell regulierte Gene nachgewiesen werden. Unter anderem zeigten sich dabei in den aus den transgenen Mäusen (Cyc+) isolierten Sca-1+ Zellen 5-fach höhere BDNF mRNA Spiegel als in den aus Wildtyptieren (Wt+) gewonnenen Zellen. Dieser Unterschied wurde auf Proteinebene bestätigt. Aufgrund der erheblich höheren Expression von BDNF im Rahmen der Herzinsuffizienz und der Publikation des Befundes, dass die intravenöse Gabe von BDNF nach einem Myokardinfarkt (MI) einen protektiven Effekt auf das Herz hat, wurde die Wirkung dieses Faktors auf Sca-1+ Zellen untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Cyc+ Zellen mit einer geringen Dosis BDNF zu einer Steigerung des migratorischen Potentials dieser Zellen führt. In aus Wildtyptieren gewonnenen Zellen war dieser Effekt nicht nachweisbar. Dem gegenüber schien bereits in den Zellen vorhandenes BDNF ohne einen weiteren externen Stimulus keine unterschiedlichen Auswirkungen in den beiden verschiedenen Zelltypen zu haben. Um die durch exogenes BDNF vermittelten Änderungen näher zu untersuchen, wurde das sogenannte „pulse SILAC-Verfahren“ verwendet. Unter BDNF Behandlung wurden 58 Proteine differentiell reguliert. Davon waren diejenigen Proteine, die mit der Zellproliferation in Zusammenhang gebracht werden können, in den Cyc+ Zellen unterdrückt, jedoch in den Wt+ Zellen induziert. Befunde von Bromodeoxyuridin-Assays (BrdU) und dem Immunoblotting weisen darauf hin, dass BDNF zur Initialisierung von Differenzierungsprogrammen führt, indem es die Zellproliferation von Cyc+ Zellen unterdrückt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass es große Unterschiede zwischen der Wirkung von BDNF auf die Proteinsynthese von Cyc+ und Wt+ Zellen gibt, was eine Steigerung des kardiogenen Potentials von Sca-1+ Zellen unter pathologischen Bedingungen nahelegt. Es ist bekannt, dass der Aldosteronspiegel bei der Herzinsuffizienz erhöht ist. Zahlreiche Daten aus experimentellen Studien haben gezeigt, dass sich ein Aldosteronüberschuss schädigend auf das Herz auswirkt. Es wurde daher die Hypothese untersucht, ob endokrine Faktoren, welche mit einer Herzinsuffizienz assoziiert sind, die Migration von CPCs beeinflussen und dadurch möglicherweise die Herstellung der Funktion im erkrankten Herzen unterstützen könnten. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Aldosteronkonzentrationen, ähnlich denen im Plasma von Herzinsuffizienzpatienten, die Migration von Sca-1+ Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um bis zu 60% steigern, während physiologische Spiegel keinen signifikanten Einfluss hatten. Gleichermaßen konnte gezeigt werden, dass der Aldosteronstimulus zu einer Aktivierung des Mineralocorticoidrezeptors (MR), der auf Sca-1+ Zellen exprimiert wird, führt und mit einer Steigerung der Migration einhergeht. Die Tatsache, dass die Gabe des MR-Antagonisten Eplerenon die Stimulation der Migration unter Aldosteron verhinderte, während die Anwendung eines Glucocorticoidantagonisten keinen entsprechenden Effekt hatte, unterstützt diese These zusätzlich. Somit weisen diese Ergebnisse auf eine potentielle Rolle von Aldosteron in der Mobilisierung von kardialen Progenitorzellen und deren Wanderung zum erkrankten Herz hin. Es wird aktuell davon ausgegangen, dass die förderlichen Effekte zellbasierter Therapien auf Reparaturprozesse des Herzens zum großen Teil durch parakrine Mechanismen vermittelt werden. Daher wurden auch Untersuchungen zum Einfluss pathophysiologischer Aldosteronspiegel auf die Proteinsekretion der Sca-1+ Zellen durchgeführt. Durch das Massenspektrometrie basierte Sekretomprofiling konnten nach 24°h Aldosteronbehandlung hauptsächlich solche Proteine mit höherer Abundanz gefunden werden, die beim Umbau der extrazellulären Matrix und dem IGF-Signalweg von Bedeutung sind. Zusätzlich wurden Galektin-1 und Gelsolin unter pathophysiologischen Bedingungen signifikant stärker sekretiert, was auf eine mögliche parakrine Beteiligung an Wundheilungsprozessen sowie ein regeneratives Potential der Sca-1+ Zellen hindeutet. Die im Rahmen dieser Promotionsarbeit gewonnenen Daten zum Proteom- und Transkriptionsmuster, die molekularen Eigenschaften der Sca-1+-Zellen aufzeigen, können als Grundlage für weitere zellbiologische Arbeiten genutzt werden. Der Vergleich der Geneexpressionsmuster von Sca1+ Zellen aus dem normalen Herzen und einem murinen Herzinsuffizienzmodell spiegelt die endogenen Veränderungen bei der Transkription im Rahmen einer Herzinsuffizienz wider, woraus kardiogene Eigenschaften der untersuchten Zellen unter pathophysiologischen Bedingungen abgeleitet werden konnten. Darüber hinaus zeigen die gewonnenen Daten die mögliche Rolle von BDNF bei der Regulation der Mobilisation und Proliferation von Progenitorzellen. Die Untersuchungen zum Einfluss von Aldosteron auf die Migration und das extrazelluläre Proteom der Progenitorzellen lieferten Erkenntnisse bezüglich möglicher positiver Effekte des Mineralocorticoids auf kardiale Zellen.

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Metadaten
Author: Rasmita Samal
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002556-2
Title Additional (German):Charakterisierung von residenten Sca-1 positiven Progenitorzellen insuffizienter muriner Herzen
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/06/20
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/05/12
Release Date:2016/06/20
Tag:Herzinsuffizienz, Progenitorzellen
GND Keyword:BDNF, Heart Failure, Microarrays, Progenitor cells, Proteomics
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology