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Anti-protamine/heparin antibodies: Molecular and functional assessment of novel approaches to inhibit antibody-mediated platelet destruction

  • Protamine is administered as protamine sulfate to reverse the anticoagulant effect of heparin following cardiopulmonary bypass surgery. Immunogenicity of protamine has been recognized for decades in several patient groups including vasectomized men, diabetic patients on protamine-containing insulin and patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery. Anti-protamine/heparin antibodies are a newly described class of heparin-dependent antibodies found in about 30% of patients exposed to protamine and heparin during cardiac surgery. A subset of seropositive patients especially who tested positive for platelet-activating anti-protamine/heparin immunoglobulin G (IgG) antibodies before surgery have prolonged postoperative thrombocytopenia with an increased risk for arterial occlusions. Studies presented in this thesis shed light on potential approaches that may prevent antibody-mediated platelet activation by anti-protamine/heparin antibodies. Two approaches are presented in this thesis, partially desulfated heparin (ODSH) and low molecular weight protamine (LMWP). Our studies demonstrated the ability of ODSH to inhibit anti-protamine/heparin antibody-mediated platelet destruction in the NOD/SCID mouse model by: i) reduction of antibody binding to preformed protamine/heparin complexes, as shown by enzyme immunoassay, ii) interfering with the binding of protamine/heparin complexes to platelets as shown by flow cytometry and fluorescence microscopy, and iii) inhibition of antibody-mediated platelet activation. Interestingly, ODSH was also able to block ongoing platelet destruction by displacing pre-bound complexes from the platelet surface. In addition, our data suggest the use of synthesized LMWP as a substitute for protamine in heparin reversal. The in vitro investigations showed that synthesized LMWP efficiently neutralizes heparin using the activated partial thromboplastin time. Anti-protamine/heparin antibodies have low binding properties to LMWP/heparin complexes as indicated in enzyme immunoassay. The ability of platelet-activating anti-protamine/heparin antibodies to induce platelet activation in the functional assay was significantly reduced in the presence of LMWP/heparin compared to protamine/heparin complexes. Owing to findings obtained in our studies, both approaches might be a promising future option to reduce anti-protamine/heparin antibody-mediated adverse effects.
  • Protamin wird als Protaminsulfat verabreicht, um die gerinnungshemmende Wirkung von Heparin nach herzchirurgischen Eingriffen mit Herz-Lungen-Maschine aufzuheben. Es ist seit Jahrzehnten bekannt, dass Protamin immunogen wirken kann. Dies betrifft folgende Patientengruppen: vasektomierte Männer; Diabetes-Patienten, die Protamin-haltiges Insulin erhalten; und Patienten mit herzchirurgischen Eingriffen unter Verwendung einer Herz-Lungen-Maschine. Anti-Protamin/Heparin-Antikörper sind eine neu beschriebene Klasse von Heparin-abhängigen Antikörpern, die von etwa 30% der herzchirurgischen Patienten unter Therapie von Protamin und Heparin entwickelt werden. Vor allem eine Untergruppe von seropositiven Patienten, die bereits vor der Operation Thrombozyten-aktivierende anti-Protamin/Heparin-Immunglobulin G (IgG) Antikörper aufwiesen, haben eine verlängerte postoperative Thrombozytopenie mit einem erhöhten Risiko für arterielle Gefäßverschlüsse. Die in dieser Arbeit vorgestellten Studien geben Aufschluss über mögliche Ansätze, die Antikörper-vermittelte Thrombozytenaktivierung durch anti-Protamin/Heparin Antikörper zu verhindern. Zwei Ansätze werden in dieser Arbeit vorgestellt: partiell desulfatiertes Heparin (ODSH) und niedermolekulares Protamin (LMWP). Unsere Studien haben gezeigt, dass ODSH den anti-Protamin/Heparin-Antikörper-vermittelten Thrombozytenabbau im NOD/SCID-Maus-Modell hemmen kann durch: i) Reduktion der Antikörper-Bindung an vorgeformte Protamin/Heparin-Komplexe, wie im Enzym-Immunoassay gezeigt wurde; ii) Inhibierung der Bindung von Protamin/Heparin-Komplexen an Thrombozyten, wie in der Durchflusszytometrie und in der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt wurde; sowie iii) Hemmung der Antikörper-vermittelten Thrombozyten-Aktivierung. Interessanterweise war ODSH auch in der Lage, den laufenden Thrombozytenabbau durch Ablösung der bereits an die Thrombozytenoberfläche gebundenen Komplexe zu blockieren. Zusätzlich deuten unsere Daten auf eine mögliche Verwendung von synthetisiertem LMWP als Ersatz für Protamin zur Neutralisierung von Heparin hin. In vitro Untersuchungen haben gezeigt, dass synthetisiertes LMWP, gemessen anhand der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit, Heparin effizient neutralisieren kann. Anti-Protamin/Heparin-Antikörper weisen eine geringe Kreuzreaktivität mit LMWP/Heparin-Komplexen auf, wie im Enzym-Immunoassay gezeigt wurde. Im funktionellen Assay war die Thrombozytenaktivierung durch Thrombozyten-aktivierende anti-Protamin/Heparin-Antikörper in Gegenwart von LMWP/Heparin-Komplexen im Vergleich zu Protamin/Heparin-Komplexen deutlich reduziert. Aufgrund der Erkenntnisse, die in unseren Studien erhalten wurden, könnten beide Ansätze eine vielversprechende zukünftige Option sein, um die anti-Protamin/Heparin-Antikörper-vermittelten unerwünschten Nebenwirkungen zu verringern.

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Metadaten
Author: Rabie Jouni
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002584-6
Title Additional (English):Anti-protamine/heparin antibodies: Molecular and functional assessment of novel approaches to inhibit antibody-mediated platelet destruction
Title Additional (German):Anti-Protamin/Heparin-Antikörper: molekulare und funktionelle Untersuchung neuer Ansätze zur Hemmung des Antikörper-vermittelten Thrombozytenabbaus
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher, Dr. Tamam Bakchoul
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/08/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/07/08
Release Date:2016/08/03
Tag:NOD/SCID mouse model
GND Keyword:Antikörper, Heparin, Herzchirurgie, Immunbiologie, Maus, Protamine, Thrombozyt, Thrombozytopenie, Zerstörung
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Transfusionsmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit