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Kristin Jahn

• Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumococci) and Staphylococcus aureus (S. aureus) belong to the Gram-positive, facultative pathogenic bacteria. They are typical commensals of the human upper respiratory tract and most people get colonized at least once during their life. Nevertheless, these potentially pathogenic bacteria are able to spread from the site of colonization to invade into deeper tissues and the blood circulation. Thereby, severe local and invasive infections like bacteremia and life-threatening sepsis can be caused. Once reaching the bloodstream, bacteria get in contact with platelets. Platelets are small, anucleated cells and the second most abundant cell type in the circulation. The role of platelets in hemostasis is well known. Circulating resting platelets sense vessel injury independent of its cause. Platelets bind to injured endothelium and exposed molecules of the underlying extracellular matrix, get activated and release intracellular adhesion proteins and different modulatory molecules. This in turn initiates activation and binding of nearby platelets resulting in closure of vascular injury by formation of small thrombi. Despite being pivotal in maintenance of the endothelial barrier they got increasingly recognized as cells with important immune functions. Platelets excert functions of the immune response by either, i) interacting with immune cells of different pathways of the immune response, ii) releasing immunomodulatory molecules stored in their granules or iii) interacting with invading pathogens via direct or indirect binding. The basis for this study were results demonstrating direct binding of different S. aureus proteins to platelets resulting in platelet activation. The identified proteins in the mentioned study are the S. aureus proteins Eap, AtlA-1, CHIPS and FlipR. Severe invasive infections with S. pneumoniae are quite often associated with development of thrombocytopenia or disseminated vascular dissemination. This frequent observation hints towards either a direct or indirect interplay of platelets with pneumococci. Hence, this study aims to analyze potential interactions and aims to decipher involved factors on both the platelet- and bacterial site. A screening of recombinant pneumococcal surface proteins identified proteins belonging to the group of lipoproteins, sortase-anchored proteins and choline-binding proteins to directly activate human platelets. Besides these surface proteins also the intracellular pneumococcal pneumolysin (Ply) induced highly increased values for the platelet activation marker P-selectin. Since Ply is a major virulence factor of S. pneumoniae the primary focus was set on involvement of this pore forming toxin on platelet activation. Surprisingly, our data revealed Ply induced platelet activation to be a false positive result based on formation of large Ply pores in the platelet membrane. In fact, it was clearly demonstrated that Ply lyses platelets even at low concentrations and thereby rendering them non-functional. Lysis of platelets could be inhibited by the addition of pharmaceutical immunoglobulin preparations as well as antibodies specifically targeting Ply. Inhibition of Ply also resulted in fully rescued platelet function either in washed platelets or in whole blood as shown by thrombus formation. Next to pneumococci also S. aureus expresses pore forming toxins, namely α-hemolysin (Hla) and different pairs of bicomponent pore forming leukocidins. Whereas the different tested leukocidins did not affect platelets, Hla acted in a two-step mechanism on human platelets. The results confirm previous data on Hla induced platelet activation via Hla resulting in e.g., reversible platelet aggregation or surface expression of activation markers. Nevertheless, platelet activation by Hla is followed by dose- and time-dependent lysis of platelets resulting in loss of platelet function and abrogated thrombus formation. Platelet lysis by Hla could neither be rescued with specific monoclonal anti-Hla antibodies nor with pharmaceutical IgG preparations containing anti-Hla IgGs. Taken together, the presented data reveal new pathomechanisms involving disturbance of platelets by bacterial pore forming toxins. Platelet lysis as well as impaired platelet function play an important role in development of severe complications during invasive infections. In life threatening infections caused by S. pneumoniae the usage of antibody formulations containing antibodies targeting Ply might be a promising approach for the prevention or even intervention and improvement of clinical outcome.
• Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, Pneumokokken) und Staphylococcus aureus (S. aureus) gehören beide zu Gram-positiven, fakultativ pathogenen Bakterien. Sie sind typische Kommensale der oberen Atemwege und die meisten Menschen werden im Laufe ihres Lebens mindestens einmal durch Pneumokokken oder Staphylokokken kolonisiert. Abgesehen von der meist asymptomatischen bakteriellen Kolonisierung können sich die Bakterien vom Ort der primären Besiedlung ausbreiten und dabei in tieferliegende Gewebe und die Blutzirkulation vordringen. In Folge dessen kann es zu lokalen und invasiven Infektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Zuständen wie Bakteriämie und Sepsis kommen. Sobald Bakterien im Blutkreislauf sind, kommen sie in Kontakt mit zirkulierenden Blutzellen. Thrombozyten (Blutplättchen) sind kleine, kernlose Zellen und nach Erythrozyten der zweithäufigste Zelltyp im Blutkreislauf. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Blutgerinnung und damit dem Verschluss verletzter Blutgefäße. Thrombozyten zirkulieren in nicht-aktivierter Form mit dem Blutstrom und erkennen Gefäßverletzungen unabhängig von deren Ursache. Sie binden an das verletzte Endothel sowie an freiliegende Moleküle der darunterliegenden extrazellulären Matrix, werden aktiviert und schütten intrazelluläre Proteine und Moleküle aus den Granula aus. Dies bewirkt die Aktivierung von weiteren Thrombozyten im Bereich der Verletzung, die sich wiederum an das Endothel anlagern und mit anderen Thrombozyten aggregieren. Die Bildung kleiner Thromben führt in der Folge zum Verschluss der Gefäßverletzung. Neben ihrer zentralen Rolle in der Blutgerinnung wurden sie in den letzten Jahren zunehmend als Zellen mit wichtigen Immunfunktionen beschrieben. Thrombozyten üben Funktionen der Immunantwort aus, indem sie entweder i) mit verschiedenen Immunzellen interagieren, ii) immunmodulatorische Moleküle freisetzen, die in ihren Granula gespeichert sind oder iii) durch direkte oder indirekte Bindung mit eindringenden Pathogenen interagieren. Die Grundlage für die vorliegende Arbeit war eine vorangegangene Studie, die eine direkte Bindung verschiedener S. aureus Proteine an Thrombozyten nachweisen konnte. Die Interaktion von Thrombozyten mit den S. aureus Proteinen Eap, AtlA-1, CHIPS und FLIPr führte zu Thrombozytenaktiverung und Aggregation. Während schwerer invasiver S. pneumoniae Infektionen werden nicht selten eine Thrombozytopenie oder eine disseminierte vaskuläre Koagulopathie als Komplikation beobachtet. Dieser Umstand lässt auf eine direkte oder indirekte Interaktion von Thrombozyten mit Pneumokokken schließen. Die vorliegende Studie hatte zum Ziel diese potentiellen Interaktionen zu analysieren und die beteiligten Faktoren auf Thrombozyten- und auf Bakterienseite zu identifizieren. In einem Screening rekombinanter Pneumokokken-Oberflächenproteine konnten Proteine aus der Gruppe der Lipoproteine, Sortase-verankerten-Proteine und Cholin-bindenden Proteine als direkt Thrombozyten aktivierende Proteine identifiziert werden. Neben den genannten Oberflächenproteinen induzierte auch das intrazelluläre porenbildende Toxin Pneumolysin (Ply) einen starken Anstieg des gemessenen Aktivierungsmarkers P-Selektin der Thrombozyten. Da Ply einer der Hauptvirulenzfaktoren von S. pneumoniae ist, wurde nachfolgend das Hauptaugenmerk auf dessen Beteiligung an der Thrombozytenaktiverung gerichtet. Überraschenderweise zeigte sich, dass die bereits zuvor beschriebene Ply induzierte Thrombozytenaktiverung ein falsch positives Ergebnis ist, das durch die Bildung großer Poren in der Membran zustande kam. Vielmehr konnte eindeutig gezeigt werden, dass Ply die Thrombozyten bereits bei niedrigen Konzentrationen lysiert und sie dadurch funktionsunfähig macht. Die Lyse von Thrombozyten konnte sowohl durch pharmazeutische Immunglobulinpräparate als auch durch spezifische anti-Ply Antikörper gehemmt werden. Durch die Neutralisation der lytischen Wirkung von Ply konnte ebenso die Funktionalität der Thrombozyten vollständig erhalten werden. Nicht nur Pneumokokken, sondern auch S. aureus exprimiert porenbildende Toxine, so z.B. alpha-Hämolysin (Hla) und verschiedene Paare der Zweikomponenten-Porenbildenden Leukozidine. Während durch die Leukozidine keine messbare Veränderung der Thrombozytenfunktion beobachtet werden konnte, beeinträchtigte Hla humane Thrombozyten in einem zweistufigen Mechanismus. Die gezeigten Ergebnisse bestätigen Daten aus anderen Studien, dass Hla Thrombozyten aktiviert. In der hier vorliegenden Studie konnte jedoch zusätzlich eine nachfolgende Hla induzierte Lyse der Thrombozyten beobachtet werden. Dieser Effekt war sowohl Dosis- und Zeitabhängig und führte zum Verlust der Thrombozytenfunktion sowie der Thrombenbildung. Im Gegensatz zu Ply konnte Hla weder mit spezifischen Antikörpern noch mit einer pharmazeutischen IgG Präparation neutralisiert werden. Zusammengefasst weisen die vorgestellten Daten auf neue Pathomechanismen bakterieller porenbildender Toxine hin, die humane Thrombozyten stark beeinträchtigen. Sowohl die toxininduzierte Lyse der Thrombozyten als auch deren beeinträchtige Funktionalität könnten ein wichtiger Faktor bei der Entstehung lebensbedrohlicher Komplikationen während invasiver Infektionen sein. Im Fall von invasiven Pneumokokkeninfektionen stellen Antikörper basierte Therapien, welche Immunglobuline gegen Ply enthalten, eine Interventionsmöglichkeit dar, um den schädigenden Effekt von Ply zu neutralisieren und damit den klinischen Verlauf zu verbessern.