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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001761-8

Identifizierung differentieller Interaktionsmuster des Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in Abhängigkeit von Arzneistoffresistenz und Rezeptorgenetik

  • Ein Netzwerk aus Rezeptoren und Signalkaskaden reguliert Wachstum, Differenzierung und Überleben von Zellen. Wird dieses Netzwerk aus dem Gleichgewicht gebracht, können die Zellen zu Tumorzellen transformieren. Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) stellt eine treibende Kraft in diesem Netzwerk dar und ist ein Ziel zahlreicher Tumortherapeutika. Aufgrund weitläufiger Resistenzbildung ist die Identifizierung verantwortlicher Strukturen von großer Bedeutung um die entarteten Signalkaskaden synergistisch einzudämmen. Nach Aktivierung des EGFR wird eine signalspezifische Antwort durch Rekrutierung von Adapterproteinen an die intrazelluläre Domäne initiiert. Die veränderte Zusammensetzung der Signalproteine könnte Angriffspunkte für neue Therapieansätze enthüllen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu entschlüsseln, wurden mehrere Proteom-Untersuchungen auf Zelllysate angewendet. Ungeachtet der Sensitivität moderner Geräte stellt die Identifizierung niedrig-abundanter Proteine im Proteom einer Zelle jedoch eine Herausforderung dar. Die Identifizierung differentieller Proteinmuster des EGFR-Interaktom in Abhängigkeit von Resistenz und Rezeptor variante war das Ziel dieser Arbeit. Der EGFR samt seiner Interaktionspartner wurde aus Zelllysaten präzipitiert. Anschließend wurden die Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und nach in-Gel-Verdau mit LC-MS/MS analysiert. Aus Lysaten von A431-Zellen wurden 183 Proteine in vier Bioreplikaten detektiert. Darunter 15 direkte Interaktionspartner, wie GRB2, SHC1, SOS1/2, STAT1/3, AP2 sowie P85B. Die Berechnung des normalized spectral abundance factor (NSAF) anhand der Anzahl gemessener Spektren und der Molekularmasse eines Proteins ermöglichte eine relative Quantifizierung der Proteinmenge. Die Menge der copräzipitierten Proteine war nach EGFR-Aktivierung durch EGF für 14 Proteine mehr als zweifach erhöht. Davon waren Untereinheiten des AP2 Komplexes am stärksten an aktivierten EGFR assoziiert. Abschließend wurde die Interaktion mit AP2 und die neu aufgedeckte Interaktion mit CIP2A durch Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse bestätigt. Nachdem die Funktionalität der Methode gezeigt werden konnte, wurde die Anwendung um das Modell einer akuten Afatinib-Resistenz erweitert. Im A431-Zellmodell wurde durch die Inkubation in Fibroblasten-konditioniertem Medium eine Resistenz gegen Afatinib beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ermittelt werden, ob sich der Einfluss der temporären Resistenz am Interaktionsmuster des EGFR widerspiegelt. Die MS-Analyse identifizierte 145 Proteine deren Assoziation an EGFR durch Afatinib mindestens zweifach verringert wurde, darunter GRB2, SOS1, SHC1, STAT2/3 sowie PK3CB und P85B. Aus dieser Analyse wurde ein Pool aus 137 Proteinen ermittelt, die potentiell Teil des induzierten Resistenzmechanismus sein könnten. 32 Proteine, darunter TNAP2, AHNK, SPTCS und der Tumorsuppressor DIDO, weisen funktionelle Ähnlichkeit zu Lungenkrebs auf. Daraufhin wurde die Methode auf das Modell einer chronisch erworbenen Resistenz der Lungenkarzinom-Zelllinie HCC4006 gegen Erlotinib angewendet. Die Analyse sollte zunächst differentielle Proteinmuster des Grundzustandes in Abhängigkeit zur erworbenen Resistenz identifizieren. Die Morphologie der Erlotinib-resistenten HCC4006-Zellen weist Merkmale einer EMT auf, die als Resistenzmechanismus für verschiedene Tumore beschrieben ist. Im Einklang mit dieser Beobachtung wurden Hinweise auf rege Veränderungen des Zytoskeletts in der vorliegenden MS-Analyse der resistenten HCC4006-Zellen gefunden. In unbehandelten Zellen wurden abhängig vom Resistenz-Status der Zellen 178 Proteine mit mindestens zweifach veränderter Assoziation an EGFR detektiert. Darunter fanden sich die Proteine der Zytoskelettreorganisation Plectin, Spectrin und ZO1, welche in resistenten Zellen bis zu 70 fach erhöht waren. Das Angiogenese-Protein Nostrin ist hingegen nach Resistenzentwicklung stark vermindert. Nach Behandlung mit Erlotinib und EGF war die Assoziation von 148 Proteinen durch Erlotinib Resistenz verändert. Darunter befanden sich HEAT1, EF1A1, UBS3B und AP3B1 die in sensitiven Zellen durch Erlotinib stärker dissoziierten als in den resistenten Zellen. Abschließend wurde die differentielle Analyse auf zwei EGFR VarianteIII (vIII) transfizierte Glioblastomzelllinien übertragen. In den P3-Zellen sind 95 Proteine in Abhängigkeit der Rezeptorvariante zweifach verändert an EGFR assoziiert. Darunter waren JAK1, GRB2, PRKDC und SNX-3, 17 und 27 vermehrt an vIII assoziiert, wohingegen PHB2 bevorzugt an Wildtyp-EGFR assoziiert. In den NCH421k Glioblastomzellen ist die Affinität für vIII bei 245 Proteinen zweifach verändert. Darunter die Phosphokinasen P85A und P85B mit stark erhöhter vIII-Affinität. Für vIII ist eine bevorzugte Initiierung des PI3K/AKT Signalweges, sowie eine konstitutive Aktivität bereits beschrieben. Mit dem Abschluss dieser Arbeit liegt ein Protokoll zur differentiellen Analyse der EGFR Interaktionsmuster vor
  • Growth, differentiation and survival of cells are regulated by a network of receptors and signaling pathways. If this network is out of balance, the cells can transform to tumor cells. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a driving force in this network and therefore a target of numerous anticancer agents. Due to extensive development of resistance, identification of responsible structures is important to synergistic degenerate aberrant signal cascades. After activation of EGFR, a signal-specific response is initiated by recruiting specific adapter proteins to the intracellular tyrosine kinase domain. The altered composition of the signaling proteins could reveal targets for new therapeutic approaches. To decipher the underlying mechanism, several proteomic studies have been applied to whole cell lysates. Despite the sensitivity of modern equipment, however, the identification of low abundant components in the proteome of a cell remains a challenge. The identification of differential protein patterns of the EGFR interactome as a function of resistance and receptor variant was the objective of this work. The EGFR with its interacting partners was precipitated from cell lysates. Subsequently, the proteins were separated by SDS-PAGE and analyzed with LC-MS/MS. From lysates of A431 cells, 183 proteins were detected in four bio replicates, including 15 direct interaction partners, such as GRB2, SHC1, SOS1/2, STAT1/3, AP2 and P85B. The calculation of the normalized spectral abundance factor (NSAF) based on the number of identified spectra and the molecular mass of a protein allowed a relative quantification of proteins. The relative quantity of co-precipitated proteins was increased more than two-fold for 14 proteins after EGFR activation by EGF. Of these, AP2 complex subunits were most strongly associated to the activated EGFR. Finally, the interaction was confirmed by AP2 and the newly revealed interacting with CIP2A by Immunofluorescence and Western blot analysis. Once the functionality of the method was demonstrated, the application has been extended to the model of acute Afatinib resistance. In the A431 cell model, an Afatinib-resistance was observed by incubation in fibroblast conditioned medium. The aim in this work was to determine whether the influence of temporary resistance is reflected in the interaction patterns of the EGFR. MS analysis identified 145 proteins whose association with EGFR was reduced by Afatinib at least two fold, including GRB2, SOS1, SHC1, STAT2/3 as well as PK3CB and P85B. In this analysis, a pool of 137 proteins were identified which potentially might be part of the mechanism of induced resistance. 32 proteins have functional similarity to lung cancer, including TNAP2, AHNK, SPTCS and the tumor suppressor DIDO. Subsequently, the method was applied to the model of chronic acquired Erlotinib-resistance in lung carcinoma cell line HCC4006. The morphology of the Erlotinib-resistant HCC4006 cells has features of an EMT, which is described as a mechanism of resistance for different tumors. Consistent with this observation, evidence of cytoskeleton (re)organization were present in MS analysis of the resistant HCC4006 cells. In untreated cells, 178 proteins were detected with at least two-fold changes in resistance depending on the association of EGFR status of the cells. Among these were the proteins of the cytoskeleton reorganization plectin, spectrin and ZO1, which were increased associated up to 70-fold in resistant cells. However, the association of angiogenic protein Nostrin is reduced by the development of resistance. After treatment with Erlotinib and EGF, the association of 148 proteins was altered by Erlotinib resistance. Among them HEAT1, EF1A1, UBS3B and AP3B1 were dissociated upon Erlotinib in sensitive cells more than in resistant cells. Finally, the differential analysis was transferred on two EGFR variantIII (vIII) transfected glioblastoma cell lines. In the P3 cells 95 proteins are changed two fold associated to EGFR depending on the receptor variant. Among them JAK1, GRB2 and PRDC as well as SNX3, 17 and 27 were increasingly associated to vIII, whereas PHB2 was preferably associated to wild-type EGFR. In the NCH421k glioblastoma cells, the affinity for vIII is changed twofold for 245 proteins. Among them, P85A and P85B phosphokinases with greatly increased affinity to vIII. A preferred initiation of the PI3K/AKT signaling pathway, as well as a constitutive activity has already been described for vIII. With the completion of this work, a protocol for differential analysis of EGFR interaction patterns is provided.

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Metadaten
Author: Sarah Foerster
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001761-8
Title Additional (English):Identification of differential interaction patterns of the epidermal growth factor receptor depending of medical resistence and receptor genetics
Advisor:Prof. Hrvoje Miletic, Prof. Dr. Christoph Ritter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/03/24
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/03/13
Release Date:2014/03/24
Tag:Bioinformatik, Interaktom, Proteinkomplexe, Systembiologie, globale Proteinanalyse, hochauflösende Proteomics
Bioinformatics, Global protein analysis, High resolution proteomics, Interactome, Protein complexes, Systems biology
GND Keyword:Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie