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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002063-2

Heterologe Produktion des Polyketids 6-Desoxyerythronolid B und des nichtribosomalen Peptids Enniatin B in Bacillus subtilis

  • Natürliche Metabolite sind Ausgangsstoff für eine Reihe von Arzneimitteln wie zum Beispiel Antibiotika. Doch bis zur Anwendung am Menschen sind viele Analyseschritte notwendig. Da viele Naturstoffe nicht in ausreichenden Mengen zur Verfügung gestellt werden können, wird deren Funktionsanalyse und Anwendung erschwert. Für dieses Defizit sind im Wesentlichen zwei Ursachen zu nennen. Entweder ist eine Vielzahl der Produzenten nicht kultivierbar oder eine ausreichende Synthese ist unter Laborbedingungen im Ausgangsstamm nicht möglich. Aus diesem Grund sind alternative Strategien wie zum Beispiel eine heterologe Expression dieser Synthese-Cluster in geeigneten Wirten notwendig. Dies war der Ansatzpunkt für die vorliegende Arbeit. Eine besondere Bedeutung innerhalb der Naturstoffe kommt der strukturell diversen und mitunter sehr komplexen Gruppe der Polyketide und nichtribosomalen Peptide zu, die oft pharmazeutisch relevante Wirkungen aufweisen. Die für ihre Synthese verantwortlichen Enzyme (PKS und NRPS) sind häufig beachtliche Multienzymkomplexe, die durch Gencluster codiert werden, deren Größe von 10–100 kbp reichen kann. Bisher wurden für die heterologe Produktion dieser Metabolite in erster Linie Actinomyceten wie zum Beispiel Streptomyces coelicolor und Myxococcus xanthus, die selbst eine Vielzahl an Polyketiden und nichtribosomalen Peptiden synthetisieren, oder Escherichia coli genutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde Bacillus subtilis, der bereits breite Anwendung in der industriellen Herstellung von technischen und pharmazeutischen Proteinen findet, erstmals als heterologer Wirt für die Synthese eines Polyketids (6-Desoxyerythronolid B) und eines nichtribosomalen Peptids (Enniatin B) eingesetzt. Zu diesem Zweck wurde ein Klonierungsprotokoll für die schnelle und wiederholte Genommodifizierung entwickelt. Dieses basiert auf der Kombination von transformationssteigernden Elementen (sogenannten six-sites) mit der chromosomalen Integration einer induzierbaren Kopie des Kompetenzfaktors ComS. Zur Markerentfernung wurde das Cre-lox-System implementiert. Durch die zusätzliche Deletion des Restriktions- und Modifikationssystems wurde eine weitere Voraussetzung zur chromosomalen Integration großer Gencluster geschaffen. Damit steht nun ein optimiertes Protokoll für die Konstruktion von B. subtilis-Expressionsstämmen und deren weiterer genomischer Modifizierung zur Verfügung. Als Vertreter einer komplexen Polyketidsynthase wurde die Desoxyerythronolid B-Synthase (DEBS) aus Saccharopolyspora erythraea ausgewählt. Dieser aus drei ca. 300–350 kDa großen Proteinen (DEBS1–3) bestehende Enzymkomplex ist für die Bildung des Makrolids 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) verantwortlich, das die Vorstufe des antibiotisch wirksamen Erythromycins darstellt. Das korrespondierende Gencluster umfasst drei ca. 10 kb große Gene (eryAI–III) und konnte erfolgreich in drei Operonstrukturen im Genom von B. subtilis lokalisiert werden: als i) natürliches Operon, ii) modifiziertes Operon mit optimierten RBS und iii) drei separate Expressionskassetten. Unter fed-batch-simulierenden Bedingungen (EnBase-System) gelang dabei ein positiver Metabolitennachweis für den Stamm mit drei separaten Expressionskassetten. Um das Zellwachstum und die 6dEB-Synthese zu verbessern, wurden weiterführende Genommodifizierungen des Produktionsstammes vorgenommen, von denen sich einige positiv auf die Produktbildung auswirkten. Mit diesem Versuch wurde erstmals die prinzipielle Eignung von B. subtilis als heterologer Produzent für komplexe Polyketide erbracht. Die Enniatin-Synthetase (ESyn) aus dem filamentösen Pilz Fusarium oxysporum wurde als Beispiel einer nichtribosomalen Peptidsynthetase in die Arbeit einbezogen. Aufgrund der handhabaren Größe des esyn-Gens (10 kb) wurde die Expression auf single- und multi-copy-Level untersucht. Dabei wurde auch der Einfluss verschiedener Genommodifizierungen und Änderungen in den Wachstumsbedingungen auf die Produktbildung analysiert. Die Kultivierungsversuche inklusive Metabolitenanalyse wurden in Kooperation mit dem Institut für Biologische Chemie an der TU Berlin durchgeführt. Abschließende Konzentrationen des entsprechenden Metaboliten (Enniatin B), einem zyklischen Hexadepsipetid mit zahlreichen antiinfektiven Wirkungen, wurden auf 4,5 µg/L (single-copy) bzw. 1,2mg/L (multi-copy) beziffert. Damit konnte in B. subtilis zum ersten Mal die heterologe Produktion eines gattungsfremden nichtribosomalen Peptids demonstriert werden. Zusammengefasst beschreibt die präsentierte Arbeit die erfolgreiche Produktion eines komplexen Polyketids und eines nichtribosomalen Peptids. Obwohl weitere Untersuchungen notwendig sind, um einige unerwartete Effekte bestimmter Genommodifizierungen aufzuklären und eine weitere Steigerung in der Produktausbeute zu erreichen, konnte eindeutig belegt werden, dass sich B. subtilis als Wirt für die heterologe Produktion von Sekundärmetaboliten eignet.
  • Secondary metabolites represent a frequently used resource for pharmaceutical drugs such as antibiotics or cytostatics. However, since most of the natural products cannot be supplied in sufficient amounts, their functional analysis as well as their application is a challenge. This is (in most cases) due to two major reasons: i) the natural producer is not cultivatable or ii) a sufficient synthesis in the natural host is impossible under laboratory conditions. Consequently, in order to improve the investigations in as well as the demand for secondary metabolites, alternative strategies are necessary. One option, the heterologous expression of the corresponding gene cluster in a suitable host-organism, served as the initial point of the present study. Within the secondary metabolites the structural diverse and quite complex groups of polyketides and non-ribosomal peptides are of particular significance since they often show a broad spectrum in bioactivities and therapeutic applications. They are produced by polyketide synthases (PKSs) and non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs), large multi enzyme complexes which are encoded by gene clusters that can reach and exceed 10–100 kbp in length. So far heterologous production of these metabolites was predominantly achieved in actinomycetes hosts (that are themselves natural producers of a large number of polyketides and non-ribosomal peptides) or in E. coli. In the present work, the synthesis of a polyketide and a non-ribosomal peptide was successfully demonstrated in the gram-positive host-organism Bacillus subtilis for the first time. To this purpose, a cloning protocol for rapid and multiple genome modification was developed. This protocol is based on transformation enhancing elements (so called six-sites) that were combined with an inducible gene copy of the competence factor ComS for an increased natural competence. For marker removal the modified Cre-lox-system was included. Additionally, in order to allow the integration of large DNA fragments, the restriction and modification system of the host was deleted. Using this optimized cloning procedure, the investigated complex gene clusters were functionally expressed in the genome of the B. subtilis host strain. The deoxyerythronolide B synthase (DEBS) from Saccharopolyspora erythraea was chosen as a representative of a complex PKS. This multi enzyme complex consists of three approx. 300–350 kDa proteins and is responsible for the production of the macrolide 6-deoxyerythronolide B (6dEB), the precursor of the antibiotic active erythromycin. The corresponding gene cluster includes three genes of approx. 10 kb in length and was transferred to the B. subtilis host genome in three different organizations as: i) native operon, ii) modified operon with optimized ribosomal binding sites (RBS) and iii) separated cluster with three independent expression cassettes. Under fed-batch-simulating expression conditions using the EnBase-technology, successful 6dEB production was verified for the host strain expressing the DEBS genes from separate cassettes. In order to improve cell growth and 6dEB synthesis, several genome modifications were realized and some of them showed a positive effect on product formation. By this approach, the proof of principle for the successful production of a complex polyketide in B. subtilis was demonstrated. Beside DEBS, the NRPS enniatin synthetase (ESyn) from the filamentous fungi Fusarium oxysporum was also investigated. Due to the manageable size of the corresponding gene (approx. 10 kb), the expression on single-copy and multi-copy-level was realized and the influence of several genomic modifications and variations of the cultivation conditions on target gene expression was analyzed. Esyn expression studies including LC-MS analysis were carried out by our collaboration partner at the TU Berlin. Final concentrations of the metabolite enniatin B, which is a cyclic hexadepsipeptide with various antimicrobial effects, were quantified to approx. 4.5 µg/L (single-copy) and 1.2 mg/L (multi-copy), respectively. This is so far the first demonstration of the heterologous production of a non-ribosomal peptide in B. subtilis which does not originate from the genus Bacillus. In summary, the present work focused on the successful production of a complex polyketide and a fungal non-ribosomal peptide in B. subtilis. Although further investigations are required to verify some unexpected effects of certain genome-modifications and to further enhance the product yield, it is clearly demonstrated that B. subtilis is a suitable host for the heterologous production of secondary metabolites.

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Metadaten
Author: Jana Kumpfmüller
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002063-2
Title Additional (English):Heterologous production of the polyketide 6-deoxyerythronolide B and of the nonribosomal peptide enniatin B in Bacillus subtilis
Advisor:Prof. Dr. Thomas Schweder
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/11/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/11/05
Release Date:2014/11/11
Tag:Metabolic Engineering, NRPS, PKS
NRPS, PKS, metabolic engineering
GND Keyword:Bacillus, Heterologe Genexpression, Sekundärmetabolit
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie