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Molekulare Mechanismen der Sphingosin-1-Phosphat-Freisetzung aus Thrombozyten

  • Thrombozyten sind von zentraler Bedeutung sowohl für die Blutstillung als auch für die Regulation von Entzündungsprozessen. Nach der Aktivierung setzen sie proinflammatorische Mediatoren wie Sphingosin-1-Phosphat (S1P) frei. Die spezifischen Mechanismen der S1P-Freisetzung aus Thrombozyten sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand eines vesikulären Transportassays bestätigt werden, dass ein ATP-abhängiges Transportsystem für S1P in Thrombozytenmembranen vorliegt. Der ATP-abhängige Transport von fluoreszenzmarkiertem S1P (F-S1P) in inside-out-Membranvesikel von humanen Thrombozyten wurde durch das organische Anion MK571, einen Inhibitor von ABC-Transportern der Multidrug Resistance Protein (MRP)-Subfamilie, gesenkt. Anhand von Transportversuchen mit inside-out-Membranvesikeln von MRP4 (ABCC4)-überexprimierenden Sf9-Insektenzellen und MRP5 (ABCC5)-überexprimierenden V79-Fibroblasten konnten MRP4 und MRP5 als S1P-Transporter identifiziert werden. Die Untersuchung von MRP4-defizienten Mäusen ergab signifikante Abnahmen der S1P-Spiegel im plättchenreichen Plasma dieser Tiere. Die S1P-Spiegel der MRP5-defizienten Männchen glichen dem WT, während die Weibchen nahezu eine Verdopplung des S1P-Gehalts im plättchenarmen Plasma im Vergleich zum Wildtyp zeigten. Die Ergebnisse bei den genetisch veränderten Mäusen lassen vermuten, dass der Transporter MRP4 auch physiologisch an der S1P-Speicherung und -Freisetzung aus Thrombozyten beteiligt ist, während MRP5 die S1P-Plasmaspiegel eher unabhängig von den Thrombozyten zu beeinflussen scheint. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der MRP4-vermittelte Transport von F-S1P durch Fluvastatin mit einer IC50 von 52 µM und Rosuvastatin mit einer IC50 von 32 µM gehemmt wird. Darauf aufbauend konnte mittels Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden, dass die Vorinkubation mit Fluvastatin bzw. Rosuvastatin die endogene stimulierte S1P-Freisetzung aus humanen Thrombozyten ex vivo senkt. Diese inhibitorische Wirkung der Statine auf den Transport des proinflammatorischen S1P stellt einen neuen möglichen Mechanismus dar, mit dem die Statine pleiotrope entzündungshemmende Effekte ausüben können. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass MRP4 als S1P-Transporter identifiziert wurde und Statine den MRP4-vermittelten Transport beeinträchtigen.
  • Platelets are relevant for haemostasis and the regulation of inflammation. Activation of platelets causes the release of proinflammatory mediators such as sphingosine-1-phosphate (S1P). The mechanism of S1P-release from platelets is still unknown. This study confirms via a vesicular transport assay an ATP-dependent transport system for S1P in membranes of platelets. The ATP-dependent transport of fluorescein-labeled S1P (F-S1P) into inside-out-membrane vesicles of human platelets was reduced by the organic anion MK571, an inhibitor of the ABC-transporters of the multidrug resistance protein (MRP)-subfamily. By studying inside-out-membrane vesicles of human MRP4 (ABCC4)-expressing Sf9-insect cells and human MRP5-expressing V79-hamster fibroblasts in transport assays, MRP4 and MRP5 were identified as transporters for S1P. Investigation of MRP4-deficient mice indicated a significant reduction of S1P-levels in platelet rich plasma of these animals. S1P-levels of MRP5-deficient male mice resembled wild-type mice, however female MRP5-deficient mice revealed a duplication of S1P-levels in platelet poor plasma compared to wild-type mice. These results of knock-out mice suggested that the transporter MRP4 might be engaged in the physiological storage and release of S1P from platelets while MRP5 seems to modulate S1P-levels independent of platelets. Furthermore, MRP4-dependent transport of F-S1P was inhibited by Fluvastatin and Rosuvastatin with IC50 values of 52µM and 32 µM. Analysis via mass spectrometry (LC-MS/MS) indicated that incubation with fluvastatin and rosuvastatin attenuated stimulated endogenous S1P-release from human platelets ex vivo. This inhibitory mechanism of statins on the transport of proinflammtory S1P may represent a new action of pleiotropic anti-inflammatory effects of statins. In summary, MRP4 was identified as a transporter of S1P and statins affect the MRP4-mediated S1P transport.

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Metadaten
Author: Katja Vogt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002850-8
Title Additional (English):Molecular mechanisms of sphingosine-1-phosphate release from platelets
Advisor:Prof. Dr. Gabriele Jedlitschky, Prof. Dr. Bernhard H. Rauch
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/07/25
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/06/15
Release Date:2017/07/25
Tag:ABC-Transporter, MRP4, Sphingosin-1-Phosphat
ABC-transporter, MRP4, platelets, sphingosine-1-phosphate, statins
GND Keyword:ATP, Freisetzung, Statin, Thrombozyt
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C30 Physiology (general)